崔惠敬，耿慧君，王麗麗,2,4，李曉宇,2,4，李淑英，徐永平,,*

(1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116024；2 教育部動物性食品安全保障技術(shù)工程研究中心，大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術(shù)公司, 大連 116620;4 遼寧省大連賽姆噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，大連 116600)

1 前言

2016年我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6901.25萬噸，其中海產(chǎn)品產(chǎn)量為3490.15萬噸，海水養(yǎng)殖產(chǎn)品產(chǎn)量為1963.13萬噸，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有了較大的發(fā)展，作為世界上唯一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈量的國家，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，成為國民經(jīng)濟的重要組成部分。然而，隨著規(guī)?；图s化養(yǎng)殖水平的提高，海水動物養(yǎng)殖業(yè)病害問題日趨嚴(yán)重，已成為制約海水養(yǎng)殖發(fā)展的一個重要因素。其中細(xì)菌是導(dǎo)致水產(chǎn)動物病害的主要病原，占生物源性疾病的57.6%[1]。

目前，主要依賴抗生素及消毒劑等化學(xué)藥物防治細(xì)菌性疾病。但由于人們對抗生素及消毒劑等化學(xué)藥物的過分濫用和依賴，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷提高、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，且水產(chǎn)品中的藥物殘留問題呈上升趨勢。殘留的藥物成分一旦進入人體，不但會影響腸道菌群，還會抑制免疫系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人類健康。而耐藥菌株感染，已成為聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)公認(rèn)的限制水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。為了減少微生物耐藥性的發(fā)生和蔓延以及控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疾病，必須尋找抗生素替代品。

目前，所研究的抗生素替代品有很多，免疫防治雖然是水產(chǎn)動物疾病控制的有效途徑，但我國魚用疫苗研發(fā)及應(yīng)用相對滯后，可用于商品化的魚用疫苗數(shù)量極其有限，遠(yuǎn)不能滿足水產(chǎn)動物疾病防治的需求。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖中急需尋找安全、天然無殘留的抗生素替代品用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病害防治。目前報道具有潛在應(yīng)用前景的水產(chǎn)用抗生素替代品包括中草藥[3]、植物精油[4]、卵黃免疫球蛋白[5]和噬菌體[6]等。

噬菌體(Bacteriophage，簡寫Phage)是生物圈中發(fā)現(xiàn)的最豐富的生物。噬菌體無處不在，僅需要一個細(xì)菌宿主，便可以進行繁殖。最近，噬菌體被用作治療病原菌的新型治療劑，引起了人們對噬菌體治療的興趣[7]。噬菌體治療可以作為一種與生態(tài)友好的抗生素替代品來預(yù)防和控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病原菌。在20世紀(jì)20年代Félix d'Hérelle首次嘗試將噬菌體治療用于人類的臨床實驗。有趣的是，這些早期的噬菌體治療試驗取得了令人印象深刻的結(jié)果。然而，研究結(jié)果極具爭議性，因為研究中存在著諸如用量控制不充分和未能設(shè)計對照組等問題[8]。由于缺乏重復(fù)性導(dǎo)致結(jié)果不一致，因此人們對噬菌體治療的研究興趣下降[9]。此外，許多化學(xué)抗生素的發(fā)現(xiàn)及其易用性進一步降低了人們對噬菌體治療研究的興趣。與此同時，噬菌體治療研究繼續(xù)在蘇聯(lián)、東歐和法國進行。

20世紀(jì)80年代初，人們重新開始對噬菌體治療產(chǎn)生了新的興趣，主要是由于多重耐藥(MDR)菌株的增多和尋找可替代抗生素等化學(xué)治療方法的愿望[10]。本文綜述了噬菌體在防治海水養(yǎng)殖動物疾病方面的研究及應(yīng)用，并展望了噬菌體防治海水養(yǎng)殖動物病害的前景，以期為海水動物養(yǎng)殖的綠色健康發(fā)展提供參考。

2 噬菌體的生命周期

噬菌體可進行兩種不同的生命周期：裂解周期和溶原周期。噬菌體附著于宿主菌表面的特異性受體上，并將其遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞提供了復(fù)制噬菌體遺傳物質(zhì)和產(chǎn)生后代噬菌體所需的分子構(gòu)建物和酶。噬菌體編碼的蛋白質(zhì)如溶菌酶和穿孔素從宿主細(xì)胞內(nèi)部進行裂解。穿孔素是小蛋白，積聚在宿主的細(xì)胞質(zhì)膜中，使內(nèi)溶素降解肽聚糖，并使子代噬菌體泄漏。隨后，在外部環(huán)境中，裂解性噬菌體可以感染和破壞所有鄰近細(xì)菌細(xì)胞。利用裂解性噬菌體產(chǎn)生大量的子代是裂解性噬菌體用于噬菌體治療的優(yōu)勢，但裂解性噬菌體具有狹窄的宿主范圍并感染特定的細(xì)菌種類?？梢酝ㄟ^噬菌體雞尾酒療法來克服這種缺乏廣泛宿主范圍的問題。在溶原性生命周期中，溫和噬菌體不立即裂解宿主細(xì)胞；取而代之的是，它們的基因組插入到宿主染色體的特定位點上。這種噬菌體DNA在宿主基因組中被稱為前噬菌體，含有前噬菌體的宿主細(xì)胞稱為溶原性細(xì)菌。前噬菌體隨著細(xì)菌宿主基因組一起復(fù)制，建立穩(wěn)定的關(guān)系。在噬菌體治療中使用溫和噬菌體的缺點是，一些噬菌體群體將其基因組插入宿主染色體，并休眠或改變宿主的表型。除非該溶原性細(xì)菌暴露于不利的環(huán)境條件，否則溶原周期可以繼續(xù)下去。噬菌體之間的感應(yīng)信號各不相同，但在抗生素治療、氧化應(yīng)激或DNA損傷中激活了細(xì)菌SOS應(yīng)答時，通常誘導(dǎo)前噬菌體的激活[11]。一旦溶原周期終止，噬菌體DNA和隨之而來的裂解周期開始表達(dá)。

根據(jù)噬菌體的侵染機制，噬菌體治療海水養(yǎng)殖動物疾病主要是利用其對致病菌的裂解作用，殺死水體和動物體內(nèi)的致病菌，從而降低或防止發(fā)病幾率。由于溶源性噬菌體不能快速裂解致病菌，起不到防治的效果。因此，人們一般篩選裂解性噬菌體用于治療疾病。

3 噬菌體治療在海水養(yǎng)殖動物中的應(yīng)用研究

細(xì)菌可引發(fā)節(jié)肢動物、軟體動物、棘皮動物以及脊索動物等多種海水養(yǎng)殖動物的傳染性疾病或感染性疾病。一旦養(yǎng)殖場中出現(xiàn)細(xì)菌性疾病，如若不及時處理，就會導(dǎo)致大面積的傳染，引起養(yǎng)殖動物發(fā)病，甚至死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。在海水養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病中，已知的病原菌有遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freudii)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V. harveyi)、嗜環(huán)弧菌(V. cyclitrophicus)、大菱鲆弧菌(V. scophthalmi)、假單胞菌(Pseudomonas spp.)等。目前細(xì)菌性疾病的防治主要還是依賴抗生素和人工合成抗菌藥，目前我國水產(chǎn)用抗生素共有4個品種，分別是氨基糖苷類的硫酸鋅霉素粉，四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素，酰胺類的氟苯尼考和甲砜霉素；另含磺胺類和喹諾酮類兩大人工合成類抗菌藥物，共11個品種[12]。但農(nóng)業(yè)部2292號公告決定自2016年12月31日起，停止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種喹諾酮類抗菌藥[13]，這也給水產(chǎn)動物病害防治帶來了挑戰(zhàn)，迫切需要研發(fā)新型抗生素替代品來防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病。表1總結(jié)了國內(nèi)外關(guān)于噬菌體療法在海水養(yǎng)殖動物中的應(yīng)用研究，以期為噬菌體控制海水養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病提供參考。

3.1 節(jié)肢動物養(yǎng)殖中的噬菌體治療

近些年，許多養(yǎng)殖節(jié)肢動物的疾病頻繁爆發(fā)，使得養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大的損失。其中弧菌病是造成對蝦養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失最嚴(yán)重的致病菌，死亡率為100%[14]。由副溶血性弧菌引起的急性肝胰壞死病一直是東南亞和拉丁美洲對蝦養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一。Jun等[15]研究噬菌體治療急性肝胰壞死病的效果，發(fā)現(xiàn)采用噬菌體pVp-1防治感染副溶血性弧菌的南美白對蝦(Penaeus vannamei)急性肝胰壞死病具有顯著保護效果，并提高存活率。噬菌體喂養(yǎng)法治療組累計死亡率為50%，浸浴法治療組累計死亡率為25%和50%。且發(fā)現(xiàn)pVp-1的預(yù)防性比治療性更好。Lomelí-Ortega等[16]發(fā)現(xiàn)，選擇裂解性噬菌體(A3S和Vpms1)能有效降低由副溶血性弧菌引起的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的死亡率，低感染復(fù)數(shù)( MOI＜0.1) 就足以殺死副溶血性弧菌，并且在感染6 h內(nèi)注射噬菌體可避免對蝦的死亡。如若在感染6 h后再進行治療，則會降低存活率，影響治療效果。胡蝶等[17]采用復(fù)相乳液法，對副溶血弧菌噬菌體(PI)進行固定，制備噬菌體微膠囊。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/kg的噬菌體添加到飼料中，并投喂凡納濱對蝦，對蝦腸道的宿主菌比對照組減少86%，水體中的宿主菌減少68%(P＜0.05)。

哈維弧菌是發(fā)光的海洋細(xì)菌，可引起對蝦的發(fā)光病。且由于哈維弧菌可形成生物膜，導(dǎo)致抗生素的治療效果降低。Karunasagar 等[18]研究了噬菌體Viha10和Viha8治療由哈維弧菌引起的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)發(fā)光病的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體的治療效果優(yōu)于抗生素。注射噬菌體治療的斑節(jié)對蝦存活率分別為88% ( Viha10) 和86%( Viha8) ，而注射氧四環(huán)素和卡那霉素的斑節(jié)對蝦存活率分別為68%和65%(P＜0.05)。Viha10和Viha8對哈維弧菌的裂解效果分別為70%和68%，但將這兩種噬菌體混合使用，裂解效果可達(dá)到94%。Vinod 等[19]也試著用噬菌體治療斑節(jié)對蝦的發(fā)光病。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在17 d的試驗周期內(nèi)，空白對照組的斑節(jié)對蝦存活率為17%，噬菌體治療組(200 ppm/d)平均存活率高達(dá)86%，與抗生素治療組40%的存活率相比，噬菌體治療具有顯著優(yōu)勢，并且隨著噬菌體使用濃度的提高，斑節(jié)對蝦的存活率也有明顯上升趨勢。

3.2 軟體動物養(yǎng)殖中的噬菌體治療

弧菌致病菌給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，對海水規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展造成了巨大的威脅。此類致病菌對方斑東風(fēng)螺，皺紋盤鮑以及牡蠣的致病性很強。

胡蝶等[17]以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 g/kg的噬菌體添加到飼料中投喂方斑東風(fēng)螺(Babylonia areolata) 。與對照組相比，東風(fēng)螺腸道宿主菌平均減少96%(P＜0.05)，水體中宿主菌減少72%(P＜0.05)?？梢娢⒛z囊可有效控制宿主弧菌在養(yǎng)殖體系中的濃度，減少養(yǎng)殖動物弧菌病的發(fā)生。柏仕杰等認(rèn)為水體中存在一定濃度的噬菌體，可使宿主弧菌濃度持續(xù)下降到一個較低濃度，并可持續(xù)控制較長時間，從而大幅度的減少養(yǎng)殖動物弧菌病的爆發(fā)。

李太武等[20]用噬菌體對河流弧菌II(V. fluvialis-II)導(dǎo)致的皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)膿皰病進行了防治研究。結(jié)果表明，使用一定濃度的噬菌體可以有效地治療或推遲膿皰病引起的盤鮑死亡，可將盤鮑的成活率提高50%以上。

榮蓉等[21]將噬菌體VPp1用于牡蠣(Concha ostreae)體內(nèi)副溶血弧菌的凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體添加濃度MOI值為0.1條件下，經(jīng)過36h的凈化，可使牡蠣體內(nèi)的副溶血弧菌數(shù)量降低2.35～2.76 log CFU/g。同樣條件應(yīng)用于工廠化規(guī)模，可使牡蠣體內(nèi)的副溶血弧菌數(shù)量降低1.11log CFU/g，另外對于牡蠣體內(nèi)的其他海洋性弧菌的增值也起到了抑制作用。與此類似，牡蠣養(yǎng)殖水體中添加噬菌體qdvp001后確實對養(yǎng)殖牡蠣環(huán)境中的副溶血弧菌具有裂解作用，可使添加濃度為1.0×108cfu/mL和1.0×106cfu/mL的副溶血弧菌濃度分別下降5個和3個數(shù)量級。與未添加噬菌體的對照組比較，可發(fā)現(xiàn)添加噬菌體后牡蠣體內(nèi)的副溶血弧菌數(shù)量明顯降低，所以對牡蠣副溶血弧菌病的預(yù)防起著積極的作用[22]。

3.3 棘皮動物養(yǎng)殖中的噬菌體治療

腐皮綜合癥已成為刺參(Apostichopus japonicus)養(yǎng)殖業(yè)最常見、危害最嚴(yán)重的疾病，嚴(yán)重制約了刺參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。幼參和成參均可被感染，其中幼參的發(fā)病率高達(dá)90%以上。2003-2005年，由刺參腐皮綜合癥引起的經(jīng)濟損失額高達(dá)20億元，這引起了廣大學(xué)者的高度重視[23]。

Zhang等[24]從一家水產(chǎn)市場的排水管中篩選出對溶藻弧菌(V. alginolyticus)Z1210敏感的噬菌體PVA1和PVA2，并制備成噬菌體雞尾酒，濃度分別為105、106、107PFU/mL。刺參通過浸泡法給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組存活率為3%，噬菌體浸浴組存活率分別為47%(105PFU/mL)、50%(106PFU/mL)和73%(107PFU/mL)。與使用抗生素5 mg/L的強力霉素組存活率80%和10 mg/L的卡那霉素組存活率47%相比，無顯著差異。

楊揚[25]從患腐皮綜合征的刺參(Apostichopus japonicus)組織中分離獲得1株嗜環(huán)弧菌(V.cyclitrophicus)和1株塔斯馬尼亞弧菌(V.tasmaniensis)，并篩選出其對應(yīng)的裂解性噬菌體PVDL-1和PVDL-2。PVDL-1噬菌體潛伏期約為35 min，裂解量約為218 PFU/cell，可將刺參存活率由45%提高到90%；PVDL-2噬菌體潛伏期約為30 min，裂解量約為110 PFU/cell，預(yù)防性和治療性實驗組可將刺參存活率從0%分別提高到95%和55%。噬菌體添加量越多治療效果越好。其中感染復(fù)數(shù)為10時，接近抗生素組的治療效果。

Li 等[26]在刺參養(yǎng)殖池水中篩選出對嗜環(huán)弧菌的噬菌體Vc1，并采用口服和注射兩種方式研究不同的給藥方式對噬菌體抑菌效果的影響。實驗結(jié)果表明，投喂含噬菌體的餌料60 d后，刺參存活率為81%，與對照組相比刺參存活率提高了63%; 然而注射噬菌體給藥后，刺參的存活率只有58%。結(jié)果顯示，對于刺參而言，口服的方式更有利于噬菌體抑菌效果的發(fā)揮。

3.4 脊索動物養(yǎng)殖中的噬菌體治療

Nanna等[27]發(fā)現(xiàn)在大西洋鱈魚(Gadus morhua)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼苗養(yǎng)殖中使用廣譜噬菌體KVP40控制四種不同鰻弧菌(V. anguillarum)引起的細(xì)菌性疾病，可有效降低幼魚的死亡率。添加噬菌體KVP40對大菱鲆幼魚的存活率有顯著增加。其中對菌株4299的處理組效果最為顯著，在8d的實驗中，大菱鲆幼苗死亡率始終低于66%。與攻毒后不使用噬菌體組相比，大菱鲆幼魚死亡率平均下降36%(P＜0.05)。在大西洋鱈魚養(yǎng)殖實驗中，噬菌體KVP40控制PF7鰻弧菌，死亡率可降低75%。實驗還證明了噬菌體KVP40對魚卵孵化時期的未知細(xì)菌也具有控制效果。

表1 海水動物養(yǎng)殖業(yè)中的噬菌體研究

Nakai 等[28]篩選出多株格乳球菌(Lactococcus garvieae)的特異裂解性噬菌體，主要可分為PLgY和PLgW系列。大部分噬菌體的潛伏期在1 h，5 h 后噬菌體效價達(dá)到最高( 1010pfu /mL) 。通過腹腔注射和口服兩種方式研究了噬菌體對病魚的治療作用。結(jié)果顯示，腹腔注射組存活率( 100%，n=20) 高于對照組存活率( 10%，n=20) ，且在感染格氏乳球菌后的不同時間段內(nèi)給藥，存活率也均有顯著差異?？诜委熃M與對照組相比，黃尾鯡魚(Seriola quinqueradiata)的死亡率顯著降低，且在口服給藥3～48 h 內(nèi)，在黃尾鯡魚的腸道及脾臟中可檢測到噬菌體的存在，最高效價達(dá)到106pfu /g。該研究表明，格式乳球菌的特異裂解性噬菌體可有效地殺滅宿主菌并可抑制其增殖，從而達(dá)到保護水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的目的，并且確定了噬菌體最佳治療時間，在實際應(yīng)用中具有重要指導(dǎo)意義。

Verner-Jeffreys等[29]將噬菌體O, R和B制備成混合制劑(1.9×108pfu/尾)，對大西洋鮭魚(Salmosalar)進行腹腔注射，可有效延緩由殺鮭氣單胞菌(78027)(Aeromonas salmonicida)引起的大西洋鮭魚的死亡速率。攻毒后立即注射噬菌體組魚的死亡速度明顯慢于未使用噬菌體處理或在24 h后注射噬菌體組。但最終結(jié)果(死亡率100%)未受影響。

Silva等[30]篩選出殺鮭氣單胞菌的噬菌體AS-A。噬菌體治療實驗中，通過浸浴的方式給藥，72 h后對照組累計死亡率達(dá)到36%，而實驗組累計死亡率為0%。該結(jié)果顯示噬菌體浸浴給藥后塞內(nèi)加爾鰨幼魚(Solea senegalensis)對致病菌的抗性顯著提高。還發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)菌存在的情況下添加噬菌體，差異并不顯著。因此，噬菌體在幼魚生長過程中，可有效且安全地預(yù)防癤瘡病。

4 噬菌體治療面臨的挑戰(zhàn)

目前,不管是在臨床研究，還是在陸地動物和魚類等的疾病防治中，噬菌體療法仍有如下一些問題。

(1)并非所有噬菌體均可以用于治療。治療性噬菌體應(yīng)具有較好的抗菌活性，并且具有較低的毒性，并確定不存在不需要的基因如毒素基因。且溶原性噬菌體不適合用于噬菌體治療。

(2)噬菌體的宿主專一性，導(dǎo)致狹窄的噬菌譜。如細(xì)菌對某些噬菌體類型產(chǎn)生耐藥性，可降低噬菌體與細(xì)菌間特異性吸附過程，從而降低治療效果。但這一問題可以通過使用噬菌體雞尾酒法來解決。

(3)噬菌體作為藥物是基于其活性蛋白，這可以與體內(nèi)免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用。也可在體內(nèi)復(fù)制，甚至?xí)谑褂眠^程中不斷進化。

5 小結(jié)

噬菌體療法雖然在魚類模擬養(yǎng)殖中取得了一定的療效，但目前大規(guī)模用于細(xì)菌感染的防治尚不成熟，有關(guān)噬菌體的各種研究正在展開。作為抗菌藥，噬菌體具有多種性質(zhì)，使其成為化學(xué)抗生素的有力替代品，而可用于治療的噬菌體都應(yīng)具有有效配方和更多的臨床實驗以及詳細(xì)的噬菌體制劑應(yīng)用方法。與早期的噬菌體治療相比，目前對噬菌體有了更深入的了解。這給噬菌體治療帶來了二次發(fā)展的機會。