周雪， 肖潮達(dá)， 賀智勇， 姜豐， 吳林菁， 肖婷， 沈祥春， 陶玲

(貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省天然藥物資源高效利用工程中心 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

阿司匹林(aspirin，Asp)已被廣泛應(yīng)用了100余年。近年來，小劑量Asp在抑制動脈粥樣硬化[1-2]、預(yù)防和治療心肌纖維化[3-4]、抑制肺纖維化[5-6]、抗腫瘤[7-8]及心血管疾病等[9-11]方面發(fā)揮了新的作用，但目前Asp的上市劑型均需要長期多次給藥，血藥濃度波動大、胃腸道副作用大、病人的順應(yīng)性差，限制了其臨床療效的發(fā)揮。微球(microspheres，MS)作為一種新型遞送系統(tǒng)，其給藥途徑廣泛，具有延緩或控制藥物釋放、增加制劑穩(wěn)定性、提高藥物生物利用度、降低毒副作用、提高療效等優(yōu)勢[12-14]，且合成可生物降解聚合物作為新型MS載體材料，由于其良好的生物相容性和生物可降解性，已被廣泛認(rèn)可和應(yīng)用[15-16]。由于藥物的物理化學(xué)性質(zhì)不同，使用不同的高分子材料可以顯著改變藥物的載藥量和包封率[17-18]。本研究以包封率、載藥量為考察指標(biāo)，對聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)和聚乙二醇-聚(乳酸-羥基乙酸)嵌段共聚物(PEG-PLGA)4種高分子材料對Asp 緩釋MS進(jìn)行考察，另就2種不同有機(jī)溶劑體系對MS制備的影響進(jìn)行了更全面的藥劑學(xué)性能研究，為制備不同要求的MS提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

S-3400N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶麥克光電儀器有限公司)，Bettersize2000型激光粒度分布儀(丹東百特儀器有限公司)，STA-449C型差示掃描量熱儀(德國Netzsch公司)，D/Max-2200型全自動X射線衍射儀(日本理學(xué)公司)，Nicolet 6700型傅里葉變換紅外分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，JNM-ECS400型核磁共振譜儀(日本JEOL公司)；Asp原料藥[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號D1316056，純度99%]，Asp對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100113-201104，純度99.9%)，PLGA、PLA、PEG-PLGA及PCL(濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，相對分子質(zhì)量均為30 kDa)，乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1Asp緩釋MS的制備 (1)高分子載體材料的考察：根據(jù)藥物的理化性質(zhì)和聚合物材料的性質(zhì)，選擇4種不同類型的聚合物PLGA，PLA，PEG-PLGA，PCL，同時選取對MS制備工藝影響較顯著的3個因素[投藥比、O/W體積比及油相比例(DCM ∶ACE)]進(jìn)行考察，以載藥量及包封率為主要考察指標(biāo)，優(yōu)選高分子載體材料。(2)Asp-PEG-PLGA-MS的制備[19]：根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到有機(jī)溶劑體系混合最佳比例，采用O/W型乳化溶劑揮發(fā)法制備Asp-PEG-PLGA-MSs，稱取適量Asp及PEG-PLGA溶解于1 mL混合有機(jī)溶劑體系中(DCM ∶ACE為3 ∶1 或 DCM ∶EA為1 ∶1)，渦旋混勻，作為油相。在1 000 r/min攪拌條件下將油相注入1% 聚乙烯醇(PVA)Asp飽和溶液中，冰浴條件攪拌，緩慢加入Asp水飽和溶液120 mL，20 min后調(diào)至室溫800 r/min攪拌4 h，靜置沉淀，去除上清液，抽濾，蒸餾水洗滌3次，室溫干燥，得到不同溶劑體系制備的MS。(3)MS載藥量及包封率的測定：稱取適量MS樣品，加入適量二氯甲烷，渦旋、離心、重復(fù)上述操作3次，合并上清液，二氯甲烷定容至25 mL；采用紫外分光光度法在波長276 nm處檢測吸光度，計(jì)算濃度，并照下式計(jì)算Asp緩釋MS的載藥量及包封率。載藥量=(MS中含藥量/最終MS實(shí)際重量)×100%，包封率=(MS中藥物含量/投入藥物量)×100%。

1.2.2MS的表征 (1)MS外觀形態(tài)觀察及粒徑測定：在倒置顯微鏡下，直接取少量MS觀察外觀形態(tài)；同時，將MS用離子濺射儀進(jìn)行表面噴金處理，采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，對MS的外觀和表面形態(tài)進(jìn)行評價；室溫條件下，取Asp-PEG-PLGA-MSs混懸液適量，用激光粒度分析儀測定MS的粒徑及其分布。(2)差示掃描熱分析(DSC)：稱取Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實(shí)驗(yàn)制得的Asp-PEG-PLGA-MSs各10 mg，將上述樣品各兩種分別進(jìn)行DSC分析，測試條件為0～180 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮?dú)夥?0 mL/min。(3)X射線衍射分析(XRD)：各稱取Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實(shí)驗(yàn)制得的Asp-PEG-PLGA-MSs適量，將上述樣品各2組分別進(jìn)行XRD分析，進(jìn)一步觀察Asp在載體材料PEG-PLGA中的分散狀態(tài)，測試條件為Cu靶，管電壓/電流為40 kV/30 mA，掃描速度4°/min，掃描范圍為0～80°。(4)核磁共振分析(NMR)：分別稱取2組Asp、PEG-PLGA、空白MS、Asp與各組空白MS的物理混合物，以及實(shí)驗(yàn)制得的Asp-PEG-PLGA-MSs各8.0 mg，溶于0.5 mL氘代氯仿中，在室溫下以1H-NMR 分析在制備過程前后Asp的核磁譜圖及研究制備過程對Asp的影響。(5)紅外光譜分析(FT-IR): MS中Asp與PEG-PLGA的相互作用通過傅立葉變換(FT-IR)進(jìn)一步分析，分別稱取上述兩組的Asp、PEG-PLGA、空白MS及實(shí)驗(yàn)制得的Asp-PEG-PLGA-MSs，加入適量干燥KBr粉末，充分混合均勻，再轉(zhuǎn)入模具中，分布均勻，抽真空下壓成透明薄片；裝入壓片夾進(jìn)行 FT-IR掃描，在400～4 000 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.3AspMS體外釋放度的考察 (1)體外累計(jì)釋放度的測定：采用動態(tài)透析法進(jìn)行Asp-PEG-PLGA-MSs體外累計(jì)釋放度的測定。精密稱取各組MS 40 mg置入透析袋中，置于具塞錐形瓶中，加入PBS緩沖液50 mL，(37.0±0.5)℃恒溫水浴搖床以100 r/min的速度振搖，在一定時間點(diǎn)上分別取出PBS 5 mL，同時補(bǔ)加等量同溫的PBS緩沖液，隨后測定吸光度，計(jì)算累積釋放百分率，繪制釋放曲線。(2)載藥MS體外釋藥模型擬合：由于168 h后兩組載藥MS累計(jì)釋放百分率均接近100%，故采取零級動力學(xué)模型、一級動力學(xué)模型、Higuchi模型、Riger-Peppas模型，對優(yōu)選處方制備的MS 168 h內(nèi)體外釋藥曲線進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果

2.1 Asp緩釋MS的制備

2.1.1高分子載體材料的考察 如表1所示，PEG-PLGA制備的MS載藥量和包封率均最高。

表1 不同聚合物對AspMS的載藥量和包封率的影響(%)Tab.1 The drug loading and encapsulation efficiency of aspirin microspheres with various p polymers

2.1.2不同溶劑體系制備Asp-PEG-PLGA-MS比較 如表2結(jié)果所示，以DCM ∶EA為有機(jī)相制備所得Asp-PEG-PLGA-MSs平均載藥量、包封率及收率均明顯高于DCM ∶ACE組MS；反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)溶劑體系為DCM ∶EA，Asp用量為10 mg時，包封率均>120%，這可能與不同有機(jī)溶劑體系導(dǎo)致高分子材料對外水相中游離藥物的吸附能力不同有關(guān)，將進(jìn)一步通過核磁共振分析來驗(yàn)證。此外，在常規(guī)攪拌4 h除去有機(jī)溶劑后，MS在洗滌和收集過程中不黏附；然而，24 h后產(chǎn)生明顯黏附現(xiàn)象，可能是內(nèi)部有機(jī)溶劑提取不完全所致；因此，本研究將MS靜置過夜，低速攪拌2 h后再進(jìn)行收集，黏附現(xiàn)象明顯改善，且不影響載藥量。

表2 不同溶劑體系制備MS的載藥量、包封率及收率比較Tab.2 Different binary solvent systems for optimal microsphere preparation

2.2 MS的表征

2.2.1MS外觀形態(tài)觀察及粒徑測定 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果表明，2種溶劑體系制備的Asp-PEG-PLGA-MSs均成球圓整，分布均勻。掃描電子顯微鏡下可見(圖1)，MS成球性良好，表面較光滑，略有小凹陷，可能為制備過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)所致；室溫條件下，取Asp-PEG-PLGA-MSs混懸液適量，用激光粒度分析儀測定MS的粒徑及其分布，結(jié)果表明，以DCM ∶ACE及DCM ∶EA制備的ASA-PEG-PLGA-MSs粒徑分別為(100.9±2.52) μm及(142.4±3.25) μm。

注：A、B為DCM ∶ACE， C、D為DCM ∶EA；A、C為光學(xué)顯微鏡下(40×)，B、D為掃描電子顯微鏡下(800×)。圖1 光學(xué)顯微鏡與掃描電子顯微鏡下Asp-PEG-PLGA-MSs形狀Fig.1 Light micrographs and scanning electron microscopy photographs of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.2DSC結(jié)果 如圖2所示，2種溶劑組DSC結(jié)果無明顯差異，Asp與各組空白MS的物理混合物均有2個明顯的放熱峰(32～37 ℃為PEG-PLGA，142～145 ℃為Asp)，然而Asp-PEG-PLGA-MSs只有一個明顯的放熱峰(32～37 ℃為PEG-PLGA)，另一個所代表Asp的放熱峰消失了，說明制備所得MS并不是2種物質(zhì)的簡單物理混合。

圖2 Asp-PEG-PLGA-MSs的DSC結(jié)果Fig.2 The DSC results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.3XRD結(jié)果 如圖3所示，Asp、Asp與各組空白MS的物理混合物的特征圖譜在0～30°均有很強(qiáng)的Asp結(jié)晶衍射峰；而兩組不同溶劑體系制得Asp-PEG-PLGA-MSs的圖譜中無明顯的Asp結(jié)晶衍射尖鋒，說明Asp-PEG-PLGA-MSs并不是簡單的物理混合，可能Asp制成MS后其晶型發(fā)生了變化，藥物可能以無定形狀態(tài)分散于載體材料中。

注：A為DCM ∶ACE， B為DCM ∶EA。圖3 Asp-PEG-PLGA-MSs的XRD分析結(jié)果Fig.3 The XRD results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.4NMR結(jié)果 如圖4所示，Asp的δ 7.14、7.35、7.62和8.12分別為苯環(huán)的次甲基(—CH—)質(zhì)子峰，δ 2.34為甲基(—CH3)質(zhì)子峰；PEG-PLGA的δ 5.20和1.65 分別為PLA的次甲基(—CH—)和甲基(—CH3)質(zhì)子峰，δ 4.81為PGA的亞甲基 (—CH2—)質(zhì)子峰，δ 3.63為PEG的亞甲基(—CH2—)質(zhì)子峰；同時，空白MS、Asp與PEG-PLGA物理混合物均在相應(yīng)位置有質(zhì)子峰，而Asp-PEG-PLGA-MSs在δ 6.90、6.95、7.48與7.90也有質(zhì)子峰的出現(xiàn)，這表明Asp可能向高場發(fā)生了化學(xué)位移，其可能是Asp的晶型改變所致。

圖4 Asp-PEG-PLGA-MSs的1H-NMR結(jié)果Fig.4 The 1H-NMR results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.2.5FT-IR結(jié)果 如圖5所示，在Asp原料藥的IR圖譜中，Asp明顯的特征峰均存在：δ= 1 696 cm為環(huán)上COOH羰基伸縮，δ=1 758 cm-1為接苯環(huán)CH3CO中的酯羰基伸縮，δ=1 610、1 570、1 480 cm分別為苯環(huán)的C骨架伸縮；高分子材料PEG-PLGA的IR譜中，δ=1 760 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，為酯羰基C=O的伸縮振動吸收峰，在δ=3 502 cm-1附近寬吸收峰為兩端的OH吸收峰，δ=2 881 cm為C-H的伸縮振動吸收峰；2類空白MS以及Asp-PEG-PLGA-MSs的IR譜中，特征峰未發(fā)生明顯改變；說明Asp制備成MS后，藥物與PEG-PLGA結(jié)構(gòu)中的主要基團(tuán)未發(fā)生改變。

圖5 Asp-PEG-PLGA-MSs的FT-IR結(jié)果Fig.5 The FT-IR results of Asp-PEG-PLGA-MSs

2.3 AspMS體外釋放度考察

2.3.1體外累計(jì)釋放度 如圖6所示，分別以一定比例的DCM ∶ACE與DCM ∶EA為溶劑的最佳工藝制備所得MS，在體外釋放實(shí)驗(yàn)中釋放MS所含80%藥物所需時間分別不低于96 h與72 h，完全釋放分別需要不低于120 h與168 h，而Asp原料藥在同一條件下，24 h釋放基本完全，說明MS有較好的緩釋作用。

圖6 不同溶劑體系制備Asp-PEG-PLGA-MSs的體外釋藥曲線Fig.6 In vitro release profile of Asp-PEG-PLGA-MSs prepared with different solvent systems

2.3.2載藥MS體外釋藥模型擬合結(jié)果 如表3所示，Riger-Peppas 模型對2組MS釋藥曲線擬合的相關(guān)系數(shù)均最大，故2組Asp-PEG-PLGA-MSs的體外釋藥比較符合Riger-Peppas釋藥模型。DCM ∶ACE組，lnQ=0.455 6 lnt+2.225 9、r2=0.982 2；DCM:EA組，lnQ=0.466 5 lnt+2.248 7、r2=0.980 8，即Asp從MS中釋放方式均為溶蝕型。

表3 Asp-PEG-PLGA-MSs 體外釋放模型擬合Tab.3 The fitting result of Asp-PEG-PLGA-MSs in vitro release

3 討論

本研究在對PLGA、PLA、PCL 及PEG-PLGA幾種高分子材料優(yōu)選中，以PEG-PLGA作為MS載體時，載藥量和包封率明顯高于其他高分子材料，這可能與PEG-PLGA的兩親性，以及Asp具有的微小溶解性能(水中溶解度為3 g/L)有關(guān)。

不同有機(jī)溶劑具有不同的物理性質(zhì)，如黏度、表面張力、水溶性及蒸汽壓等，都直接影響MS的粒徑大小、載藥量、包封率、穩(wěn)定性及體外釋放。有機(jī)溶劑溶解度越高，向水中擴(kuò)散速度越快，而乙酸乙酯的溶解度介于二氯甲烷和丙酮之間；蒸汽壓越高，脫除速率越快，導(dǎo)致聚合物的沉積與固化速率加快[20]，乙酸乙酯的蒸汽壓低于丙酮和二氯甲烷。因此，乙酸乙酯彌補(bǔ)了丙酮被快速萃取，將藥物一并帶出的不足，進(jìn)而提高了載藥量和包封率。另外，采用DCM ∶EA制備Asp-PEG-PLGA-MSs，投藥量在10 mg時，包封率均超過100%，原因可能是在上述溶劑特性的影響下，當(dāng)乳滴進(jìn)入PVA飽和Asp溶液后，MS固化過程中，外水相中的游離Asp被吸附于MS表面所導(dǎo)致。

本研究的DSC和XRD分析結(jié)果表明，所制得MS并不是藥物與載體材料的簡單物理混合，而是藥物可能以無定形狀態(tài)分散在載體材料中。此外，本研究還采用NMR與IR考察Asp與PEG-PLGA在不同溶劑中的化學(xué)結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Asp與PEG-PLGA在主要功能基團(tuán)上未發(fā)生結(jié)合，但是IR圖譜中表明，2組空白MS和高分子材料PEG-PLGA在一些非功能基團(tuán)上發(fā)生了一定改變。

體外累計(jì)釋放度的測定結(jié)果顯示，2組MS體外初始釋放時，釋放藥物速度均較高，可能是由于MS表面吸附的Asp在釋放初期迅速解吸附導(dǎo)致。此外，由于MS體外初始釋放時藥物濃度較高，具有較大的勢能，更加促進(jìn)藥物的擴(kuò)散[21]。24 h后，隨著表面藥物的完全釋放，藥物MS的釋放隨之受到載體材料降解速度的限制，使MS以較為恒定的速度緩慢釋放藥物。另外，2組MS的體外釋藥在48～96 h內(nèi)略有不同，藥物從DCM ∶EA組MS釋放較DCM ∶ACE組稍多，這可能與其載藥量和粒徑大小相關(guān)：DCM ∶EA組MS的載藥量幾乎是DCM:ACE組MS載藥量的兩倍，DCM ∶EA組MS的粒徑超過DCM ∶ACE組MS的40%，有明顯更大的比表面積。

綜上，綜合上述各項(xiàng)性能指標(biāo)結(jié)果可知，不同高分子材料和有機(jī)溶劑體系共同影響載藥MS的粒徑、形態(tài)、載藥包封及釋放行為。這為制備不同要求的AspMS提供了參考價值與依據(jù)。