粟莎莎， 張姝， 黃健， 陳曦， 李艷， 方立超， 鄧鈞， 莫非**， 鄭峻松**

(1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 3.陸軍軍醫(yī)大學 藥學與檢驗醫(yī)學系， 重慶 400038)

DNA甲基化是DNA化學修飾的一種形式，在細胞分化、基因表達調控及基因組穩(wěn)定等方面起著重要作用[1-3]。研究表明，異常DNA甲基化與癌癥等人類很多疾病相關，肺癌CDKN2A基因、肝癌ARID2基因、結腸癌CDKN2A基因及白血病HOXA10基因等甲基化可作為腫瘤標志物[4-10]，因此，DNA甲基化檢測對于腫瘤的預測、診斷和治療具有重要意義。傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測技術主要有甲基化敏感限制性內切酶分析 (MSRE)[11]、重亞硫酸氫鹽測序 (Bisulfite-Seq)[12]和甲基化免疫共沉淀(MeDIP)[13]，這些方法大多操作繁瑣、耗時，且需要昂貴的儀器設備[14-16]，而DNA電化學傳感器因操作簡便、快速、靈敏，能選擇性識別待分析對象中的電化學活性物質，是理想的快速分析DNA甲基化的手段[17-19]。目前大多數應用電化學傳感器檢測DNA甲基化的研究主要是通過檢測DNA甲基轉移酶活性以間接反映DNA甲基化水平，而不能精確測定DNA中5-甲基胞嘧啶(5-mC)的水平[20-23]；此外，DNA甲基轉移酶僅催化雙鏈DNA中特定序列發(fā)生甲基化，不能定量檢測多甲基化位點的靶序列。本研究擬構建一種簡單、直接，能有效分析DNA序列中5-mC數量的電化學生物傳感器，從而為臨床DNA甲基化位點的定量檢測提供一種簡便有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1DNA序列 實驗所用探針及不同甲基化數量的靶DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成，-20 ℃保存?zhèn)溆?，見?。

表1 實驗所用DNA序列Tab.1 The base sequences of DNA used in this experinment

注：“/i5med C/”表示甲基化位點，DNA S0為非甲基化DNA，DNA S1～S5分別為含有1、2、3、4、5個甲基化位點的靶DNA。

1.1.2主要試劑 鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6·3H2O)、氯化鉀(KCl)、氯金酸(HAuCl4·3H2O)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、巰基己醇(MCH)及牛血清白蛋白(BSA)均購自上海生工生物工程有限公司，5-mC抗體及HRP-IgG購自Abcam公司，氯化鈉(NaCl)、硝酸鉀(KNO3)、氯化鎂(MgCl2)購自國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris-EDTA, TE)緩沖液、對苯二酚、氯化鉀(KCl)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其他所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.1.3儀器 超聲波清洗儀、電子天平、CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)，電極為三電極體系，輔助電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為金電極(直徑為2 mm)。

1.2 方法

1.2.1納米金修飾金電極(AuNPs/Au)的制備 將直徑為2 mm的金電極用0.05 μm的Al2O3粉打磨成鏡面，然后分別在超純水、無水乙醇、超純水中超聲清洗5 min。室溫晾干后，將電極放入現配的Piranha溶液(98% H2SO4與30% H2O2按3 ∶1的體積混合)中活化15 min以上，然后用超純水徹底清洗干凈，氮氣吹干。將上述處理好的金電極浸入3 mmol/L HAuCl4·3H2O(含0.1 mol/L KNO3)溶液中，于-0.2 V電位下沉積120 s，最后用超純水充分淋洗干凈，制得AuNPs/Au。

1.2.2DNA電化學傳感器的制備 向AuNPs/Au電極表面滴加10 μL含有0.1 μmol/L 探針DNA、50 mmol/L NaCl和1.0 mmol/L TCEP的1×TE緩沖液(pH 7.4)，于4 ℃孵育過夜，使末端巰基化的DNA探針通過Au-S鍵固定在電極表面。取出電極，用PBS充分淋洗去除多余吸附的DNA，即制得單鏈DNA(ssDNA)修飾的AuNPs/Au(ssDNA/AuNPs/Au)。然后滴加1 mmol/L MCH 10 μL，室溫放置1 h，以封閉電極表面的空白位點，PBS淋洗電極后氮氣吹干。繼續(xù)滴加10 μL含0.1 μmol/L靶DNA、50 mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2的1×TE緩沖液(pH 7.4)，于37 ℃水浴箱雜交90 min。雜交完成后，電極用PBS重復沖洗3次，得到雙鏈DNA(dsDNA)修飾的AuNPs/Au(dsDNA/AuNPs/Au)，即制得實驗所用DNA電化學傳感器。

1.2.3抗5-mC和HRP-IgG的固定 將上述制備的電極用5% BSA室溫封閉30 min以防止后續(xù)加入抗體的非特異性吸附。向電極表面滴加10 mg/L抗5-mC抗體10 μL，37 ℃孵育1 h后，再次淋洗電極；繼續(xù)滴加80 mg/L HRP-IgG 10 μL，于室溫孵育30 min；以上兩步反應每一步后均用PBS重復淋洗3次后再進行下一步操作。

1.2.4電化學測定 在含1 mmol/L H2O2和1 mmol/L對苯二酚的PBS溶液中，采用差分脈沖伏安法(DPV)進行電化學測定。測定參數：電位掃描范圍- 0.3 ～ 0.1 V、采樣間隔0.016 7 s、脈沖寬度0.05 s、脈沖周期0.2 s、靜止時間2 s。

1.3 觀察指標

(1)對電極進行電化學表征，裸金電極經過納米金修飾、探針固定、MCH封閉及靶序列雜交的修飾，每一步修飾后均在含0.1 mol/L KCl的1 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中采用循環(huán)伏安法(CV)進行電化學表征；(2)DNA甲基化電化學測定條件的優(yōu)化，包括雜交時間的優(yōu)化及抗5-mC抗體濃度的優(yōu)化；(3)可行性分析，對甲基化和非甲基化DNA進行電化學測定，區(qū)分甲基化與非甲基化DNA；(4)DNA甲基化位點定量分析，分別對DNA S1～S5進行檢測，觀察DPV峰電流與靶DNA甲基化位點數量的關系；(5)重復性及穩(wěn)定性檢測。

2 結果

2.1 電極的電化學表征

采用CV法進行電極的電化學表征，結果顯示，裸金電極在0.2～0.3 V出現一對明顯的氧化還原峰，電勢差小于0.1 V，提示[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面轉移速度快；當電沉積納米金后，由于電極表面的AuNPs有效提高電極比表面積，促進電子轉移，所以氧化還原峰電流增高；當電極表面修飾上探針后，由于其帶負電荷的磷酸骨架排斥溶液中同樣帶負電荷的離子擴散至電極表面，所以氧化還原峰電流減小，氧化峰與還原峰之間的電位差增大。同樣，當MCH成功修飾上電極后，排斥溶液中同樣負電荷的[Fe(CN)6]3-/4-，峰電流進一步減?。划斉c靶序列雜交后，由于電極表面的負電荷增多，峰電流繼續(xù)減小，氧化還原峰之間的電位差進一步增大。電化學表征結果表明各成分均成功修飾到電極上，電極組裝成功。見圖1。

注：a為裸金電極，b為納米金修飾金電極，c為探針固定，d為MCH封閉，e為靶序列雜交。圖1 DNA電化學傳感器自組裝CV表征Fig.1 Characterization of CV obtained for the self-assembling biosensor

2.2 DNA甲基化電化學測定條件的優(yōu)化

2.2.1雜交時間的優(yōu)化 雜交時間是影響傳感器性能的重要因素，隨著雜交時間從0延長到180 min，DPV峰電流一開始迅速增大，雜交90 min后變化不大，為了節(jié)約時間，提高傳感器分析效率，最終選擇90 min為最優(yōu)雜交時間。見圖2。

2.2.2抗5-mC抗體濃度的優(yōu)化 抗體濃度直接影響其與5-mC的結合，因此，需要對抗5-mC抗體濃度進行優(yōu)化。隨著抗體濃度增加，峰電流迅速升高，但當抗體濃度超過10 mg/L，電流趨于平緩，說明反應達到飽和，因此，選擇10 mg/L濃度為最佳濃度。見圖3。

2.3 DNA甲基化電化學檢測的可行性分析

由于甲基化DNA能特異性結合抗5-mC抗體，與抗體結合的HRP-IgG能催化H2O2還原產生電流，通過測定電流的大小可區(qū)分甲基化和非甲基化DNA。實驗結果表明，非甲基化DNA的DPV峰電流極其微弱，可能是由于部分抗5-mC抗體非特異性吸附在電極表面而形成；而甲基化DNA則出現較強的峰電流，約5.2 μA，說明該方法可以有效區(qū)分甲基化與非甲基化DNA。見圖4。

圖2 雜交時間對DPV峰電流的影響Fig.2 Effect of hybridization time on DPV peak current

圖3 抗5-mC抗體濃度對DPV峰電流的影響Fig.3 Effect of anti 5-mC concentration on DPV peak current

注：a為甲基化DNA，b為非甲基化DNA。圖4 甲基化與非甲基化DNA的DPV檢測信號Fig.4 DPV signal of methylated and unmethylated DNA

2.4 DNA甲基化位點定量分析

分別對0.1 μmol/L 的DNA S1～S5進行檢測，隨著DNA甲基化位點數量的增加，DPV峰電流隨之增高，以甲基化位點數量和DPV峰電流值分別為橫縱坐標作圖，并計算得回歸方程I(μA)=1.598N+3.309，r=0.991，在1～5個甲基化位點范圍內，DPV峰電流與靶DNA甲基化位點的數量呈線性關系。 見圖5。

注：a、b、c、d、e分別為1、2、3、4、5個甲基化位點。圖5 不同數量甲基化位點的DPV曲線及回歸曲線Fig.5 The DPV curve obtained from methylated DNA with different numbers of methylation sites and the regression curve

2.5 重復性及穩(wěn)定性

在相同條件下，對含一個甲基化位點的靶DNA重復測定5次，得到相對標準差(RSD)約為6.49%，證明該方法重復性在可接受范圍內。此外，將制備的傳感器于0.1 mol/L PBS溶液中4 ℃放置28 d，結果峰電流仍維持在最初峰電流的92.6%，表明所制備的傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

電化學傳感分析是通過將分析體系中識別分子與靶分子的相互作用轉化為電響應信號而實施的一類具有響應快速、靈敏度高、操作方便、成本低等優(yōu)點的新型分析技術，在臨床疾病的快速診斷、療效觀察等方面具有廣闊的應用前景[24-26]。

電極的組裝是DNA甲基化分析的關鍵技術之一，本實驗通過電沉積的方式將AuNPs修飾到電極表面后，末端巰基化的DNA探針與AuNPs之間形成Au-S鍵使得探針牢牢固定在電極表面，利用MCH封閉電極表面的空白位點，防止DNA非特異性吸附，靶DNA與探針之間則通過堿基互補配對的作用雜交形成雙鏈DNA，從而將靶DNA連接到電極表面。對電化學生物傳感器的每一步修飾效果用CV進行表征，最先當電極表面修飾上AuNPs后，氧化還原峰電流增高，說明電沉積制備的AuNPs有效促進了電子轉移，從而提高傳感器的靈敏度。當在電極表面依次組裝上探針DNA、MCH和靶DNA后，由于其帶負電荷的磷酸骨架排斥溶液中同樣帶負電荷的粒子擴散至電極表面，所以氧化還原峰電流逐漸減小，氧化峰與還原峰之間的電位差增大。這些結果表明，各成分均成功修飾到電極上，電極組裝成功。

為了提高傳感器的性能，研究中對雜交時間和5-mC抗體濃度兩個重要條件進行了優(yōu)化，實驗結果表明，雜交時間為90 min可獲得最佳雜交效果，5-mC抗體濃度為10 mg/L為最佳孵育條件。在此優(yōu)化的條件下，本實驗分析了含1、2、3、4、5個甲基化位點的靶DNA，以5-mC抗體為捕獲抗體，以HRP標記的抗5-mC抗體IgG作為電化學信號示蹤物，結果表明，DPV峰電流的大小是與靶DNA中甲基化的數量成正比的，所以該方法可用于DNA甲基化位點的定量分析。由于大多數報道主要通過甲基轉移酶催化產生的單個甲基化位點進行檢測，不能分析多個甲基化位點的DNA靶序列，并且由于不同個體內環(huán)境差異可能對酶活性產生影響，因而，通過檢測甲基轉移酶的活性來反映甲基化水平并不是最可靠的分析手段。在本研究中，隨著甲基化位點數量的增多，結合到電極表面的HRP-IgG就越多，因此獲得的電流信號就越高，通過DPV峰電流大小與DNA甲基化位點的數量關系，實現了DNA甲基化位點的定量檢測，線性方程為I(μA)= 1.598 N+3.309，相關系數為0.991。

綜上所述，本研究成功構建用于DNA多甲基化位點定量分析的電化學生物傳感器，方法簡單、直接、特異性好，無需重亞硫酸氫鹽轉化和PCR擴增等繁瑣的步驟，有望應用于癌癥和其他相關疾病的臨床診斷及發(fā)病風險的評估。