,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長春 130118;2.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室,吉林長春 130118)

鹿尾(Cauda Cervi)為鹿科動物梅花鹿(CervusnipponTemminck)或馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)的尾巴,是我國傳統(tǒng)的名貴的藥材和滋補(bǔ)強(qiáng)壯劑?！吨腥A本草》記載:“鹿尾,補(bǔ)腎陽、益精氣等功效,可用于治療腰脊疼痛、腎虛遺精、頭昏耳鳴等疑難雜癥[1]”?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí),鹿尾具有顯著增強(qiáng)性腺功能[2],益腎填精、抗衰老、抗疲勞、提高機(jī)體免疫力[3]等功效。徐海娜等[4]以Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,研究梅花鹿公尾對其生長性能的影響,結(jié)果表明梅花鹿公鹿尾粉可以促進(jìn)幼鼠生長發(fā)育,顯著提高大鼠體增重,產(chǎn)生較高的代謝能,為機(jī)體提供更多能量。但該實(shí)驗(yàn)以鹿尾粉末即全成分進(jìn)行給藥,并未對其進(jìn)行有效成分進(jìn)行探究。

動物類中藥有效成分多以蛋白多肽類為主,蛋白質(zhì)是生命體活動的物質(zhì)基礎(chǔ),在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用?；钚远嚯挠刑厥獾纳碚{(diào)節(jié)功能,添加此類物質(zhì)的功能性食品可以用來預(yù)防或調(diào)節(jié)慢性病。吳帆等[5]以鹿茸不同部位水提蛋白對NRK-49F細(xì)胞促增殖作用進(jìn)行研究,結(jié)果表明所有樣品對細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用,且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。胡旭陽等[6]對日本黃姑魚魚肉多肽進(jìn)行酶解提取,以酶解多肽對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的相對增殖率為指標(biāo)對多肽活性進(jìn)行評價(jià)。以新鮮海參或干品海參為原料,加工得到的海參肽具有抗腫瘤、降血壓等功效,可作保健食品食用,也可作食品、藥品添加劑使用[7]。該類藥物還在預(yù)防和治療疾病中具有用藥劑量小、療效好、毒副作用低等突出優(yōu)點(diǎn)[8],因此具有較大開發(fā)利用價(jià)值。

超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的振動、空化效應(yīng)來使此溶劑浸提法達(dá)到提取的目的。超聲波作用可以使液體破裂成較多小空穴,當(dāng)這些小空穴閉合時(shí),可產(chǎn)生的瞬時(shí)壓力高達(dá)幾千個(gè)大氣壓,同時(shí)在輔助提取的過程中,能夠有效地破壞原料物外層結(jié)構(gòu),使內(nèi)容物質(zhì)釋放,加速有效成分進(jìn)入溶劑,增加有效成分的提取率[9]。水酶法提取蛋白具有反應(yīng)條件溫和,水解過程易于控制和效率高等優(yōu)點(diǎn),且所得產(chǎn)物多具有促礦物結(jié)合[10]、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[11]。因酶解所得多肽產(chǎn)物具有安全性高、生理功效明顯及易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn),成為目前功能性食品的研究熱點(diǎn)[12-13]。因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取法和水酶法對鹿尾蛋白與多肽進(jìn)行提取,以鹿茸蛋白的提取方法為參照[14],優(yōu)化了超聲水提鹿尾蛋白工藝,比較了超聲水提蛋白和水酶法提取鹿尾多肽對小鼠TM3細(xì)胞增殖活性,旨在為鹿尾的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥鹿尾 吉林雙陽鹿廠;胃蛋白酶(30000 U/g)、木瓜蛋白酶(60000 U/g)、胰蛋白酶(60000 U/g)、考馬斯亮藍(lán)G250、BSA標(biāo)準(zhǔn)品、精氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶公司;中性蛋白酶(60000 U/g) 購自北京奧博星公司;小鼠TM3細(xì)胞 武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清 美國Hyclone公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 美國Gibco公司;CCK-8試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所;乙醇、磷酸等常規(guī)化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

ST16R型號高速冷凍離心機(jī)、Multiskan FC型酶標(biāo)儀、Heraeus 240i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Heratherm OGS100型號電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 美國Thermo公司;KQ-500DE型號超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;HHS型恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;LGJ-12型冷凍干燥機(jī) 天津凱易達(dá)有限公司;DV215CD型天平 美國奧豪斯;FE20型號PH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多;各型號微量移液器 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿尾中基本成分分析 蛋白質(zhì)含量測定方法參照GB 5009.5-2010[15],采用凱氏定氮法進(jìn)行測定;脂肪含量的測定方法參照GB/T5009.6-2003[16]的方法,將樣品置于索式提取器中,用石油醚來進(jìn)行脂肪提取;灰分含量測定參照GB 5009.4-2010[17]的方法,將樣品置于(550±25) ℃下煅燒4 h,稱量殘?jiān)馁|(zhì)量;水分含量的測定參照GB 5009.3-2010[18]的方法,將樣品在(105±1) ℃的烘箱中干燥至恒重。

1.2.2 超聲水提鹿尾蛋白工藝流程 鹿尾粉碎過40 目篩,稱取1 g鹿尾粉末后按照一定料液比(g/mL)與水混合,4 ℃浸泡24 h后,放入超聲中,在一定的超聲功率和溫度條件下反應(yīng)一段時(shí)間,8000 r/min離心5 min,取上清液。將上清液倒入培養(yǎng)皿并放置于真空干燥箱中冷凍干燥48 h,得鹿尾蛋白粉末。

1.2.3 超聲水提鹿尾蛋白的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.2下法提取鹿尾蛋白,固定反應(yīng)條件為超聲功率100 W,提取時(shí)間1 h,提取溫度40 ℃,考察不同料液比(1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15 g/mL)對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響;固定反應(yīng)條件為料液比1∶8 g/mL,提取時(shí)間1 h,提取溫度40 ℃,考察超聲功率(100、200、300、400、500 W)對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響;固定反應(yīng)條件為料液比1∶8 g/mL,超聲功率300 W,提取溫度40 ℃,考察不同提取時(shí)間(0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 h)對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響;固定反應(yīng)條件為料液比1∶10 g/mL,超聲功率300 W,提取時(shí)間1 h,考察不同提取溫度(4、25、40、60、100 ℃)對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲水提鹿尾蛋白工藝參數(shù) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出超聲水提鹿尾蛋白的最佳條件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.4 蛋白酶解法制備鹿尾多肽工藝 鹿尾粉碎過40目篩,稱取2 g鹿尾粉末后按照1∶5 g/mL的料液比與水混合,在沸水中煮1 h,冷卻后調(diào)節(jié)到各酶最適pH,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的酶(表2)在各最適溫度條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)3 h,待酶解結(jié)束,沸水中滅酶5 min,8000 r/min 10 min離心,取上清液放入真空冷凍干燥箱中冷凍干燥48 h,得到水酶法提取多肽粉末。各蛋白酶最適條件見表3。

表2 不同蛋白酶最適水解參數(shù)Table 2 Optimal hydrolysis parameters of different proteases

1.2.5 胰蛋白酶酶解鹿尾多肽的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化胰蛋白酶酶解多肽工藝參數(shù) 根據(jù)胰蛋白酶最適水解參數(shù)及單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選出胰蛋白酶酶解所得鹿尾多肽的最佳條件。見表3。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.6 分析測定方法

1.2.6.1 蛋白含量測定 采用Bradford 法進(jìn)行蛋白濃度測定[19]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,配置200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液后倍比稀釋成100、50、25、12.5、6.25 μg/mL,取各濃度溶液1 mL后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液充分混勻,靜置反應(yīng)15 min,用酶標(biāo)儀在595 nm下測定吸光值,以蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值(A)為縱坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0012x+0.1996R2=0.9937。將待測樣品配置成1 mg/mL溶液,取100 μL后加去離子水補(bǔ)足至1 mL,在加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液充分混勻,靜置反應(yīng)15 min,用酶標(biāo)儀在595 nm下測定吸光值,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

凍干產(chǎn)物得率(%)=凍干產(chǎn)物質(zhì)量×100/投料質(zhì)量

1.2.6.2 水解度測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法進(jìn)行水解度測定[20]。以精氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.94x-0.044R2=0.999。取200 μL樣品溶液加入到盛有1.5 mL OPA的離心管中,充分混勻,避光反應(yīng)2 min,同時(shí)未水解樣做空白對照實(shí)驗(yàn),340 nm 下測定吸光值,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水解度如下:

h=(ht-he)×DF

DH(%)=h(100/htot

式中:ht為樣品的吸光度從標(biāo)曲上所得濃度,mg/mL;he為對照品(未水解樣品)的吸光度從標(biāo)曲上所得濃度,mg/mL;htot為全部酶解液的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上所得濃度,mg/mL;DH為樣品的水解度,%;DF為樣品的稀釋倍數(shù)。

1.2.6.3 小鼠TM3細(xì)胞增殖測定

1.2.6.3.1 小鼠TM3細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞株使用DMEM培養(yǎng)基,全營養(yǎng)液是指含10%的胎牛血清和1% 雙抗(青-鏈霉素)的培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至對數(shù)生長期即匯合度達(dá)到90%左右時(shí),棄去原培養(yǎng)液,使用1×PBS洗滌3次,加入0.25%胰酶進(jìn)行消化,待細(xì)胞變圓后,棄去加入全細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。將細(xì)胞吹打均勻后按實(shí)驗(yàn)要求接種到細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6.3.2 CCK-8法測定細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期的TM3細(xì)胞調(diào)整其密度至1×105個(gè)/mL,每孔100 μL接種于96 孔板中。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再將用全營養(yǎng)液稀釋好的1 mg/mL鹿尾提取物溶液加入,每孔6個(gè)重復(fù)。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每隔30 min于酶標(biāo)儀450 nm下進(jìn)行一次吸光度數(shù)值的測定,待空白組數(shù)值趨進(jìn)于1時(shí),停止培養(yǎng),記錄數(shù)值。細(xì)胞增殖率計(jì)算如下[21]。

式中:A試驗(yàn)為具有細(xì)胞,CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度數(shù)值;A背景為無細(xì)胞具有培養(yǎng)基和CCK8溶液的孔的吸光度數(shù)值;A空白為無藥物溶液的具有細(xì)胞和CCK8溶液的孔的吸光度數(shù)值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0軟件數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行差異性顯著分析,其中P<0.05差異顯著,P<0.01差異極顯著;Office excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖,每次試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)原料鹿尾中基本成分

經(jīng)測定,鹿尾中水分含量為28%±0.46%,灰分含量5.65%±0.57%。去除水分含量以干質(zhì)量計(jì)鹿尾中的粗蛋白質(zhì)為60.25%±1.32%,脂肪含量為28.57%±0.84%,所以鹿尾中有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪。

2.2 超聲水提鹿尾蛋白單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對超聲水提鹿尾凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響 由圖1可以看出,凍干產(chǎn)物得率隨著提取液用量的增加逐漸增大,當(dāng)料液比為1∶8 g/mL時(shí),達(dá)到最大值;與料液比為1∶10之后的試驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異,即料液比為1∶8以后,隨著提取液用量的增加,凍干產(chǎn)物得率的變化不顯著(P>0.05)。而提取物中蛋白質(zhì)含量,則是在料液比1∶5 g/mL時(shí)達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)樘崛∫河昧吭龃?鹿尾粉末與水的接觸面積增大,雖提高了提取物擴(kuò)散速度,但也使得蛋白質(zhì)含量有所下降。而當(dāng)料液比超過1∶8 g/mL時(shí),蛋白質(zhì)分子之間的吸附作用、蛋白質(zhì)分子與水之間的擴(kuò)散作用趨于平衡,導(dǎo)致蛋白溶出率無顯著變化(P>0.05)。因此,綜合兩項(xiàng)衡量指標(biāo),在本試驗(yàn)條件下,適宜料液比為1∶8 g/mL。

圖1 料液比對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on yieldand protein content of freeze-dried products注:小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),圖2～圖7同。

2.2.2 超聲功率對超聲水提鹿尾凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響 由圖2可以看出,在超聲功率小于300 W時(shí),凍干產(chǎn)物的得率和其蛋白含量呈現(xiàn)顯著的升高趨勢(P<0.05),當(dāng)超聲功率為300 W時(shí),凍干產(chǎn)物得率達(dá)到最大值。在超聲功率400 W時(shí),提取物蛋白含量達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著超聲波功率的增大,空化作用和機(jī)械作用越強(qiáng)烈,分子擴(kuò)散速度也就越大[22],蛋白質(zhì)分子滲出越快,蛋白溶出量增大;而當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W時(shí),蛋白質(zhì)的得率無顯著變化(P>0.05),并且在高功率提取時(shí)對儀器的損耗較大。因此,選擇300 W為最佳提取功率。

圖2 超聲功率對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on yield and proteincontent of freeze-dried products

2.2.3 提取時(shí)間對超聲水提鹿尾凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響 由圖3可以看出,隨著超聲時(shí)間的延長,鹿尾凍干產(chǎn)物得率和其蛋白質(zhì)含量在0.3～1 h之間極顯著增大(P<0.01),超過1 h增加緩慢,當(dāng)超聲時(shí)間為1 h時(shí),凍干產(chǎn)物得率和蛋白質(zhì)含量均達(dá)到最大值,之后延長時(shí)間提取率的變化不顯著(P>0.05)。這是因?yàn)樵诔晻r(shí)間低于1 h時(shí),隨著超聲波處理時(shí)間的延長,超聲波空化作用增強(qiáng),使細(xì)胞破碎程度增大,加速了細(xì)胞內(nèi)部可溶性物質(zhì)的溶出速度,凍干產(chǎn)物得率和蛋白質(zhì)含量增大;當(dāng)超聲時(shí)間超過1 h以后,可能是由于細(xì)胞破碎到一定程度,產(chǎn)物提取率也達(dá)到平衡。所以,考慮到節(jié)約資源和成本選擇適宜超聲時(shí)間為1 h。

圖3 提取時(shí)間對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量影響Fig.3 Effect of extraction time on yield andprotein content of freeze-dried products

2.2.4 提取溫度對超聲水提鹿尾凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量的影響 由圖4可以看出,在溫度4～40 ℃范圍內(nèi),隨著溫度升高,凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量增加顯著(P<0.05),此時(shí)蛋白含量達(dá)到最大值。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí),凍干產(chǎn)物得率達(dá)到最大值,超過40 ℃蛋白質(zhì)得取率略微下降,這是因?yàn)殡S著溫度的升高,蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動速度加快,有利于蛋白質(zhì)分子分離出來,而溫度超過40 ℃,蛋白質(zhì)可能部分發(fā)生凝膠作用而沉淀,使提取率下降。所以選擇適宜提取溫度為40 ℃。

圖4 提取溫度對凍干產(chǎn)物得率和蛋白含量影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yieldand protein content of freeze-dried products

2.3 超聲水提鹿尾蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以凍干產(chǎn)物中蛋白含量作為評價(jià)指標(biāo),利用正交試驗(yàn)篩選出超聲水提鹿尾蛋白的最佳工藝參數(shù),試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 超聲水提鹿尾蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal test design and results ofultrasonic water extracting deer tail protein

由極差分析可得出影響超聲水提鹿尾工藝的主次因素為料液比>提取時(shí)間>超聲功率>提取溫度,最佳提取條件是A1B1C2D3,即提取料液比1∶5 g/mL、超聲功率200 W、提取時(shí)間1 h、提取溫度40 ℃。按最佳理論條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測得其蛋白含量為60.72%±0.56%。

2.4 各蛋白酶最適條件下的水解度及小鼠TM3細(xì)胞增殖活性

如圖5所示,不同蛋白酶酶解物的水解度和對小鼠TM3細(xì)胞的增殖率存在一定的差異;胰蛋白酶解物的水解度最高值為23.33%,其次為木瓜蛋白酶(19.17%)和中性蛋白酶(14.92%),胃蛋白酶的水解度最低(9%)。如圖6,胰蛋白酶的TM3細(xì)胞的增殖率(128.32%)最大,胃蛋白酶(112.03%)次之,中性蛋白酶和木瓜木瓜蛋白酶的TM3細(xì)胞的增殖率均較低?？梢钥闯?胰蛋白酶具有最大的水解度,且胰蛋白酶酶解產(chǎn)物(1 mg/mL)對TM3細(xì)胞的增殖率也最高;而木瓜蛋白酶解物,擁有較高的水解度,其TM3細(xì)胞增殖率卻只107.32%;這可能是因?yàn)榕c木瓜蛋白酶相比,胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)暴露出了更多的活性位點(diǎn),從而使得酶解產(chǎn)物擁有更高的細(xì)胞增殖率。綜合比較了四種不同蛋白酶的酶解效果,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選取了具有最大的水解度,且對TM3細(xì)胞的增殖率也最高的胰蛋白酶進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化。

圖5 各蛋白酶最適條件下的水解度Fig.5 Degree of hydrolysis of eachprotease under optimal conditions

圖6 各酶最適條件下的水解產(chǎn)物對小鼠TM3細(xì)胞的增殖率Fig.6 Proliferation rate of TM3 cells by hydrolysisproducts under optimal conditions of each enzyme

2.5 胰蛋白酶酶解鹿尾多肽正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以水解度為評價(jià)指標(biāo),利用正交試驗(yàn)篩選出胰蛋白酶酶解鹿尾多肽的最佳工藝參數(shù),試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 酶解鹿尾多肽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of orthogonaltest for enzymatic deer tail protein

由極差分析可得出影響胰蛋白酶酶解鹿尾工藝的主次因素為提取溫度>pH>加酶量>酶解時(shí)間,最佳提取條件是A1B2C3D2,即提取pH8、加酶量1500 U/g、酶解時(shí)間4 h、提取溫度50 ℃。按最佳理論條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測得水解度為22.85%±0.35%。

2.6 兩種提取方式下鹿尾提取物對小鼠TM3細(xì)胞增殖活性的影響

圖7 兩種最優(yōu)工藝下產(chǎn)物對小鼠TM3細(xì)胞的增殖率Fig.7 Proliferation rate of TM3 cellsby two optimal processes

將兩種最優(yōu)工藝下的鹿尾提取物稀釋后(濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)進(jìn)行TM3細(xì)胞的增殖測定。結(jié)果如圖7所示,無論是鹿尾的超聲提取物還是胰蛋白酶酶解產(chǎn)物均對TM3細(xì)胞有增值作用,且隨著濃度的增大增殖效果越顯著,呈濃度依賴關(guān)系,與空白組差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)可以看到鹿尾胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的TM3細(xì)胞增殖活性在各個(gè)濃度上均優(yōu)于鹿尾超聲水提物。其原因可能是在超聲水提物中所得鹿尾蛋白多數(shù)為大分子,而在胰蛋白酶的作用下所得鹿尾多肽為小分子居多。酶解可將鹿尾蛋白分解成小肽段,能大量破壞其結(jié)合表位,獲得活性肽[23-24],故更利于細(xì)胞的生長和增殖。

3 結(jié)論

鹿尾超聲提取最佳工藝為:料液比1∶5 g/mL、超聲功率200 W、提取時(shí)間1 h、提取溫度40 ℃。鹿尾胰蛋白酶酶解最佳工藝為:提取pH8、加酶量1500 U/g、酶解時(shí)間4 h、提取溫度50 ℃。

鹿尾超聲水提物和胰蛋白酶水解產(chǎn)物對TM3細(xì)胞均有增殖作用,并在0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)增殖作用隨著濃度的增加而增大。在本試驗(yàn)所選濃度中,相同濃度下,鹿尾胰蛋白酶酶解產(chǎn)物TM3細(xì)胞增殖活性均優(yōu)于超聲水提物。酶解可將鹿尾蛋白分解成小肽段,可大量破壞其結(jié)合表位,獲得活性肽。因此,實(shí)驗(yàn)所得的鹿尾多肽的酶解條件對鹿尾食品藥品的研究有重要意義。中藥藥效的發(fā)揮主要是通過其內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)實(shí)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)中僅以鹿尾水提物作為研究對象,并未比較研究鹿尾的不同提取物的藥理功效,可進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)提取及藥理學(xué)試驗(yàn),進(jìn)一步探索鹿尾的藥理活性及保健功效,為今后鹿尾的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。