郭曉梅 郭雷
山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司 山東濟寧 272100
恩拉霉素(Enramycin)是由包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子組成的多肽類抗生素,包含恩拉霉素A和恩拉霉素B兩種成分,其對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用,它有利于飼料營養(yǎng)成份的消化吸收,提高飼料利用率,是一種全新的動物專用抗生素促生長劑[1]。
目前,微生物學(xué)效價方法測定恩拉霉素含量較為普遍,在《進口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中,也是采用的微生物學(xué)方法,該方法操作復(fù)雜且有一定缺點,而高效液相色譜法由于其快速、準(zhǔn)確、操作方便的優(yōu)點,應(yīng)用較為廣泛。將HPLC法應(yīng)用到對恩拉霉素的檢測中,必然會給生產(chǎn)與研發(fā)帶來便捷。而HPLC法測定恩拉霉素含量的文獻鮮見報道。
戴安U-3000高效液相色譜儀和UV檢測器;梅特勒AB104-N型電子天平;FE20型酸度計。
恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品(含量為968u/mg)、恩拉霉素發(fā)酵液、恩拉霉素預(yù)混劑均有魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司提供;
甲醇浸提液:甲醇:2M鹽酸:水=20:1:21(V/V/V)
島津WondaSil C18(200×4.6mm,5μm,)為測定色譜柱,乙腈:50mM磷酸二氫鈉 3:7(V/V,pH 4.5±0.1)為流動相,267nm的波長,1.0ml/min的流速,柱溫選擇室溫,進樣20μL,運行20min。
取恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg,精密稱定,置50ml容量瓶中,用甲醇浸提液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別精密量取該液2、4、6、8、10ml置于10ml量瓶中,用甲醇浸提液定容至刻度,搖勻,作為工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液,恩拉霉素含量分別為200、400、600、800、1000( mg/ml)。
發(fā)酵液樣品處理:取發(fā)酵液2ml于一試管中,加18ml甲醇浸提液,搖勻后超聲30分鐘,離心后取上清液過0.45um濾膜(尼龍66)過濾,即得。
4%預(yù)混劑樣品處理:精密稱取1.00g 4%預(yù)混劑(或閃蒸粉)于 250ml三角瓶中,加入100ml甲醇浸提液,搖勻后超聲半小時,離心10分鐘,上清液用0.45μm濾膜過濾,即得。
分別將制備好的工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液用HPLC測定,以恩拉霉素濃度x(mg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=1695.4x+18095,相關(guān)系數(shù)R2=0.999。結(jié)果表明恩拉霉素在濃度200-1000mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[2]。
在選定的色譜條件下,用恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣5次,峰面積分別為 1702661、1704500、1704890、1704279、1707223,RSD為0.10%,由數(shù)據(jù)可知其精密度較好。
將供試品溶液放置12小時,測定初始值后,每隔兩個小時測定一次,對應(yīng)峰面積分別為1679528、1679282、1677904、1675449、1677717、1676122、1681359,
RSD為0.10%,說明在12小時內(nèi)溶液比較穩(wěn)定。
精密吸取已知含量的供試品溶液,分別加入一定量的恩拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用HPLC測定,回收率為99.42%,RSD為2.08%,回收率良好。
(1)改變柱溫:分別改變柱溫為 24.5℃、25.0℃、25.5℃,進樣后記錄主峰峰面積和保留時間,并計算3針峰面積,分別為1755334、1725755、1725514,RSD 為 0.99%, 表 明 在 24.5-25.5℃適用該操作。
(2)改變色譜柱批號:選擇相同品牌,不同序列號(9E9601-03、2A9601-06、2A9601-09)的色譜柱進行驗證,結(jié)果表明峰面積RSD為0.41%。
(3)改變流速:按照±10%的變量選擇0.9和1.1mL/min,進樣后記錄主峰峰面積和保留時間,峰面積RSD為0.02%,表明流速在0.9-1.1ml/min范圍適用該操作。
取恩拉霉素發(fā)酵液、恩拉霉素預(yù)混劑各3批樣品,按上述方法制備供試品溶液,用高效液相色譜儀檢測,記錄峰面積,按外標(biāo)法計算預(yù)混劑含量,1602003批次為4.02%,1603001批次為3.98%,1603002為4.05%,說明批預(yù)混劑含量差異較小,樣品含量測定方法比較穩(wěn)定[3]。
采用高效液相色譜法檢測恩拉霉素發(fā)酵液及預(yù)混劑中恩拉霉素的含量,實驗所得線性方程為:y=1695.4x+18095,相關(guān)系數(shù)R2=0.999,線性關(guān)系較好,該方法的回收率都95%-105%之間,符合分析要求。通過實驗可知,我們選定的方法操作簡便、準(zhǔn)確度高、耐用性好等優(yōu)點,能有效的檢測發(fā)酵液、預(yù)混劑中恩拉霉素的含量。