駱嘉原,孫凱峰,包怡紅

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

黑木耳(Auriculariaauricula),又稱黑菜,木耳科,木耳屬,是一種藥食兩用真菌,公認(rèn)的保健食品之一。在神農(nóng)氏時(shí)期,人們就已經(jīng)開始食用,栽培黑木耳[1]。黑木耳多糖為黑木耳子實(shí)體的主要功能性成分,主要由水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖和兩種酸性雜多糖構(gòu)成[2]。黑木耳多糖具有抗炎癥、降低血脂、抗血栓形成、降低血液粘度、降低血糖、抗凝血、抗腫瘤、抗糖尿病、抗衰老等作用,是一種能夠增強(qiáng)人體免疫功能和抗腫瘤作用的生物活性物質(zhì)[3-15]。

近年來(lái),糖尿病已經(jīng)成為影響人體健康的慢性疾病之一,發(fā)病率與死亡率日益增高,并且患病人群也逐漸由中老年人群轉(zhuǎn)向年輕人群[16]。高血糖會(huì)對(duì)人體的眼、腎、心血管等造成損傷,因此降低血糖是控制糖尿病危害的主要途徑[17]。有研究表明多糖能夠抑制α-淀粉酶的活性從而抑制高聚糖的分解,達(dá)到降低血糖水平的目的。這與多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性有較大的關(guān)聯(lián),但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[18]。木耳多糖被發(fā)現(xiàn)有良好的降血糖能力,宗燦華等[19]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖對(duì)正常小鼠和糖尿病小鼠血糖均有降低效果,且對(duì)糖尿病小鼠的作用效果更顯著。尹紅力等[20]通過(guò)建立體外α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型對(duì)黑木耳多糖的體外降血糖功能進(jìn)行評(píng)估,該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑木耳酸性多糖通過(guò)影響葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝酶的活性而達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的目的。

現(xiàn)今已有學(xué)者對(duì)木耳多糖的提取及功能活性的測(cè)定進(jìn)行了研究,表明木耳多糖有良好的生物活性和廣闊的應(yīng)用前景。但大部分研究?jī)H僅利用酶法提取多糖,文獻(xiàn)利用酶對(duì)多糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。木耳多糖是聚合度較高的高分子碳水化合物,通過(guò)酶解轉(zhuǎn)化為分子量較小的低聚糖,使更多的活性基團(tuán)暴露,可能會(huì)使其擁有更好的生物活性。因此,本實(shí)驗(yàn)以黑木耳為原料,采用復(fù)合酶法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行提取及降解達(dá)到生物轉(zhuǎn)化的目的,并選取α-淀粉酶抑制率及葡萄糖透析延遲指數(shù)作為衡量降血糖性能的指標(biāo),同時(shí)監(jiān)測(cè)多糖得率及分子量組成的變化。以期為黑木耳多糖的生物酶法改性提供理論依據(jù),也為黑木耳的開發(fā)利用提供新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 家樂(lè)福超市;纖維素酶(5000 U/g)、酸性蛋白酶(60000 U/g)、胰蛋白酶(300 U/g)、木瓜蛋白酶(45000 U/g)、果膠酶(40000 U/g)、糖化酶(10000 U/g)北京博奧拓達(dá)科技有限公司;堿性蛋白酶(60000 U/g)、α-淀粉酶(13000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(20000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;中性蛋白酶(60000 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;DG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 西安禾普化工儀器有限公司;TDL-40B-W型離心機(jī) 上海標(biāo)儀儀器有限公司;FA1004型分析天平、722S可見分光光度計(jì)、982S紫外風(fēng)光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DK-512電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。Agilent 1260 infinity HPLC-GPC系統(tǒng)、Agilent1362A示差折光檢測(cè)器 安捷倫科技有限公司;300 mm×7.8 mm×5 μm G2000SWXL色譜柱 TSK株式會(huì)社。

1.2 黑木耳粉的制備

將黑木耳清洗,浸泡,挑選,瀝干后,80 ℃烘箱干燥,高速粉碎機(jī)粉碎,過(guò)100目篩,得木耳粉備用。

1.3 黑木耳多糖的提取

1.3.1 黑木耳酶解多糖的提取 精確稱取1 g木耳粉,置于錐形瓶中,加入一定量蒸餾水,攪拌均勻,用0.1 mol/L NaOH溶液(或0.1 mol/L HCl溶液)調(diào)節(jié)體系pH,加入相應(yīng)的酶,并將錐形瓶放入水浴鍋中,恒溫酶解一段時(shí)間后取出,離心得到多糖提取液,醇沉過(guò)夜,得黑木耳酶解多糖。

1.3.2 黑木耳非酶解水提多糖的制備 精確稱取1 g木耳粉,置于錐形瓶中,以1∶60的料液比與蒸餾水充分混合,100 ℃水浴2 h,取出離心,上清液為非酶解水提多糖提取液,醇沉過(guò)夜,得黑木耳非酶解水提多糖。

1.4 黑木耳多糖酶法生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 酶制劑的篩選 依據(jù)酶制劑的作用位點(diǎn)不同,選取纖維素酶、果膠酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶,糖化酶,胰蛋白酶,以每種酶的最適條件(表1)進(jìn)行酶解處理,以多糖降血糖性能及其得率考察酶解效果。

表1 酶解反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of enzyme

表2 復(fù)合酶解方案Table 2 Complex enzymatic hydrolysis scheme

1.4.2 復(fù)合酶加酶方式的確定 選取酶解效果較好的三種酶制劑進(jìn)行復(fù)合酶解試驗(yàn),分同時(shí)加入及分步加入考察加酶方式對(duì)多糖降血糖性能及其得率的影響,具體酶解方案見表2,固定總加酶量500 U/g,加酶配比1∶1∶1。其中,酶分步加入時(shí),每種酶的反應(yīng)時(shí)間相同,當(dāng)一種酶反應(yīng)結(jié)束后,100 ℃水浴5 min進(jìn)行滅酶,冷卻至室溫后,重新調(diào)節(jié)反應(yīng)條件,再按表加入相應(yīng)的酶。

1.4.3 復(fù)合酶總加酶量的確定 在確定酶制劑種類及加酶方式的基礎(chǔ)上,研究總加酶量(400,500,600,700,800 U/g)對(duì)黑木耳多糖體外降血糖性能及其得率的影響。

1.4.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響 固定酶解溫度50 ℃,酶解pH5.0,料液比1∶60 (g∶mL),考察不同酶解時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響。

1.4.4.2 酶解溫度對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響 固定酶解時(shí)間2 h,酶解pH5.0,料液比1∶60 (g∶mL),考察不同酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響。

1.4.4.3 酶解pH對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響 固定酶解時(shí)間2 h,酶解溫度50 ℃,料液比1∶60 (g∶mL),考察不同酶解pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響。

1.4.4.4 料液比對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響 固定酶解時(shí)間2 h,酶解溫度50 ℃,酶解pH6.0,考察不同料液比(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g∶mL)對(duì)多糖得率及降血糖性能的影響。

1.4.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 參照單因素試驗(yàn),選取總加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH為影響因素進(jìn)行L9(43)正交實(shí)驗(yàn),以多糖降血糖性能及得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 黑木耳多糖的精制

1.5.1 脫蛋白 參照文獻(xiàn)[21-22]的方法,略作修改,采用Sevag法對(duì)黑木耳酶解多糖和非酶解水提多糖進(jìn)行脫蛋白處理,將Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)與黑木耳多糖水溶液以4∶1的比例混合,置于分液漏斗中,劇烈震蕩后,靜置30 min,保留上層水層,除去中間層及下層雜質(zhì)。重復(fù)以上萃取操作四次?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定溶液脫蛋白前后多糖含量。根據(jù)式(1)計(jì)算多糖損失率:

多糖損失率(%)=(脫蛋白前多糖含量-脫蛋白后多糖含量)/脫蛋白前多糖含量×100

式(1)

1.5.2 脫色 參考文獻(xiàn)[23]的方法,略作修改,采用H2O2法對(duì)黑木耳酶解多糖和非酶解水提多糖進(jìn)行脫色處理。調(diào)節(jié)多糖溶液的pH至8.0(0.1 mol/L NaOH溶液),50 ℃恒溫放置,緩慢加入20%體積的5%雙氧水,反應(yīng)2 h,直至顏色不再變化。分光光度法測(cè)定溶液脫色前后490 nm處吸光值及多糖含量。并根據(jù)式(2)、(3)計(jì)算脫色率及多糖損失率。

脫色率(%)=(脫色前吸光度值-脫色后吸光度值)/脫色前吸光度值×100

式(2)

多糖損失率(%)=(脫色前多糖含量-脫色后多糖含量)/脫色前多糖含量×100

式(3)

1.6 黑木耳多糖酶解效果分析

采用高效凝膠液相色譜對(duì)水提多糖和酶解多糖進(jìn)行色譜分析,參考文獻(xiàn)[24-25],分別精確稱取水提多糖和酶解多糖1 mg,加入適量超純水溶解,100 mL容量瓶定容,配制為1 mg/mL的溶液,0.22 μm水系濾膜過(guò)濾,進(jìn)行色譜分析,得到色譜圖。色譜條件:色譜柱為G2000SWXL色譜柱(300 mm×7.8 mm×5 μm);流動(dòng)相為超純水;流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;柱操作壓力為1.6 MPa;進(jìn)樣量10 μL,采用示差檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)分析

1.7.1 多糖含量及得率的計(jì)算

1.7.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取葡萄糖干燥標(biāo)品2.5 mg,蒸餾水250 mL定容,制成0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,再用蒸餾水補(bǔ)齊至2 mL,以2 mL蒸餾水管作為空白對(duì)照。每支試管中加入1 mL的苯酚溶液(濃度為9%),然后馬上滴加5 mL濃硫酸,20 ℃放置20 min,搖勻,充分混合,再放置10 min,在490 nm處測(cè)其吸光值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[26-27]。

1.7.1.2 樣品多糖含量的測(cè)定及得率計(jì)算方法 吸取1 mL多糖提取液,蒸餾水稀釋100倍制成待測(cè)溶液。利用苯酚硫酸法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量,并根據(jù)式(4)計(jì)算多糖得率。

式(4)

式中:X-樣品吸光值對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上多糖含量(mg/mL);100-最終稀釋后的溶液體積(mL);V-上清液體積(mL);M-黑木耳干品質(zhì)量。

1.7.2 體外降血糖性能的測(cè)定

1.7.2.1 對(duì)α-淀粉酶活力抑制的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[28]的方法略作修改,稱取α-淀粉酶5 mg,置于錐形瓶中,加入1 mL 5 mg/mL樣品多糖溶液,室溫放置30 min,使二者充分結(jié)合。加入15 mL 4%的可溶性淀粉溶液,30 ℃恒溫震蕩1 h。4500 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定葡萄糖含量。同時(shí)做空白對(duì)照。根據(jù)式(5)計(jì)算α-淀粉酶活力抑制率:

α-淀粉酶活力抑制率(%)

式(5)

1.7.2.2 葡萄糖透析延遲指數(shù)的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[29]的方法略作修改,在10 mL 100 mmol/L的葡萄糖溶液中加入1 mL 5 mg/mL樣品多糖溶液,均勻混合,37 ℃恒溫震搖1 h后,將混合液轉(zhuǎn)移到10 cm長(zhǎng)、截留分子量為7000的透析袋中,同時(shí)做空白對(duì)照。將透析袋放于盛有150 mL去離子水的燒杯中,37 ℃恒溫振搖1 h。分別在30、60 min時(shí)測(cè)定透析液中葡萄糖含量。葡萄糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。根據(jù)式(6)計(jì)算葡萄糖透析延遲指數(shù):

葡萄糖透析延遲指數(shù)(%)

式(6)

1.7.3 正交綜合評(píng)分 試驗(yàn)以α-淀粉酶抑制率和多糖得率為雙指標(biāo),參照文獻(xiàn)[30-31],將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理、統(tǒng)一數(shù)量級(jí),對(duì)酶解效果進(jìn)行綜合評(píng)分。按照式(7)中計(jì)算各指標(biāo)綜合評(píng)分Y′ij:

式(7)

1.8 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SPSS Statistics 20和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖,各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來(lái)表示。正交設(shè)計(jì)與分析采用正交設(shè)計(jì)助手軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)葡萄糖的濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度的線性關(guān)系,可以繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到回歸方程。其結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 酶制劑的篩選

由圖2、圖3可知,在其他條件相同時(shí),使用糖化酶時(shí)木耳多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高,其α-淀粉酶抑制率為15.59%,優(yōu)于其他酶類,同時(shí)在其作用下,木耳多糖的葡萄糖透析延遲指數(shù)相較其它酶類也有較優(yōu)表現(xiàn),30 min時(shí)為29.54%,60 min時(shí)為16.69%。這說(shuō)明木耳多糖能有效吸附葡萄糖,具有較強(qiáng)的葡萄糖延遲吸收能力,隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng),木耳多糖對(duì)葡萄糖的吸附達(dá)到飽和,因此60 min時(shí)葡萄糖透析延遲指數(shù)較30 min時(shí)略低。因此,綜合來(lái)看,糖化酶酶解后得到的木耳多糖擁有更好的降血糖性能。這可能是由于糖化酶能夠水解多糖中的α-1,4和α-1,6糖苷鍵,多糖降解為小分子糖或寡糖,使其活性增強(qiáng)的緣故[32]。

圖2 不同酶制劑對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響Fig.2 Effects of different enzyme preparationson α-amylase inhibition rate

圖3 不同酶制劑對(duì)葡萄糖透析延遲指數(shù)的影響Fig.3 Effects of different enzyme preparationson glucose dialysis delay index

由圖4可知,使用纖維素酶時(shí),木耳多糖的得率最高,糖化酶、果膠酶次之。由此根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算綜合評(píng)分,糖化酶的綜合評(píng)分最高為17.50,木瓜蛋白酶和果膠酶次之,分別為15.27、14.46,且圖中可以看出樣本間的誤差變異性不大。因此綜合考慮多糖體外降血糖性能及其得率,糖化酶的作用效果最好,明顯優(yōu)于其他酶類。以上試驗(yàn)結(jié)果可能是由于酶的作用位點(diǎn)不同,提取出的多糖的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有所差別,造成其生物活性與得率有所不同[33]。因此,本實(shí)驗(yàn)選取木瓜蛋白酶、糖化酶、果膠酶復(fù)配用以進(jìn)行下一部分的實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同酶制劑對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of different enzymepreparations on polysaccharide yield

2.3 復(fù)合酶加酶方式的確定

選取木瓜蛋白酶、糖化酶、果膠酶三種酶制劑,總加酶量500 U/g,加酶配比為1∶1∶1,分同時(shí)加入與分步加入進(jìn)行加酶方式研究。酶解方案及結(jié)果見表4。

表4 復(fù)合酶提取木耳多糖的評(píng)分結(jié)果Table 4 The score of extracting polysaccharidesfrom Auricularia auricula by complex enzyme

由表4可知,根據(jù)綜合得分,木瓜蛋白酶、糖化酶、果膠酶同時(shí)加入時(shí)綜合得分最高,α-淀粉酶抑制率最高,體外降血糖性能最好,這可能是分步加入時(shí)三次高溫滅酶處理及pH調(diào)節(jié)導(dǎo)致反應(yīng)底物結(jié)構(gòu)與性質(zhì)變化所導(dǎo)致的結(jié)果。雖同時(shí)加入時(shí)多糖得率比果膠酶→木瓜蛋白酶→糖化酶方案略低,但α-淀粉酶抑制率最高,故選擇同時(shí)加入木瓜蛋白酶、糖化酶、果膠酶同時(shí)加入的加酶方式。

2.4 復(fù)合酶總加酶量的確定

由圖5可知,α-淀粉酶抑制率隨總加酶量的增加而增加,總加酶量在700 U/g時(shí),綜合評(píng)分值達(dá)到最高,為21.36。多糖的α-淀粉酶抑制率為19.73%,也達(dá)到最高,此時(shí)多糖得率為25.17%。當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí),α-淀粉酶抑制率呈下降趨勢(shì)。因此確定總加酶量為700 U/g以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 總加酶量對(duì)多糖提取效果的影響Fig.5 Effect of total enzyme amounton extraction of polysaccharides

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響 由圖6可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),多糖α-淀粉酶抑制率與多糖得率均逐漸增加。酶解時(shí)間為2 h時(shí)提取效果最好,此時(shí)多糖α-淀粉酶抑制率達(dá)到最大值,為20.82%,綜合評(píng)分為22.64,達(dá)到最高。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2 h后,α-淀粉酶抑制率與多糖得率均呈下降趨勢(shì)。所以選擇最佳酶解時(shí)間為2 h。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis timeon extraction of polysaccharides

2.5.2 酶解溫度對(duì)多糖提取效果的影響 由圖7可知,α-淀粉酶抑制率隨著溫度的上升而增加,當(dāng)溫度升到50 ℃時(shí),α-淀粉酶抑制率最高,為23.61%,此時(shí)綜合評(píng)分為24.51,達(dá)到最高。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),α-淀粉酶抑制率與多糖得率均呈下降趨勢(shì)。所以選擇最佳酶解溫度為50 ℃。

圖7 酶解溫度對(duì)多糖提取效果的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis temperatureon extraction of polysaccharides

2.5.3 酶解pH對(duì)多糖提取效果的影響 由圖8可知,伴隨著pH的升高,α-淀粉酶抑制率也不斷升高,當(dāng)pH為6.0時(shí),提取效果最好,此時(shí)α-淀粉酶抑制率為26.95%,多糖得率為30.28%,綜合評(píng)分為27.949。當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí),兩個(gè)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)。所以選擇最佳pH為6.0。

圖8 pH對(duì)多糖提取效果的影響Fig.8 Effects of pH on extraction of polysaccharides

2.5.4 料液比對(duì)多糖提取效果的影響 由圖9可知,隨著料液比的升高,α-淀粉酶抑制率也逐漸升高,在料液比為1∶60時(shí)提取效果最好,此時(shí)α-淀粉酶抑制率為27.98%,多糖得率為30.53%,綜合評(píng)分值為28.75。料液比過(guò)高會(huì)稀釋底物和酶的濃度,因此隨著料液比的提高與α-淀粉酶抑制率逐漸下降。所以選擇最佳料液比為1∶60。

2.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

正交試驗(yàn)以α-淀粉酶抑制率和多糖得率為雙指標(biāo),通過(guò)綜合得分衡量酶解效果,試驗(yàn)結(jié)果如表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments

圖9 料液比對(duì)多糖提取效果的影響Fig.9 Effect of ratio of material to liquidon extraction of polysaccharides

表5正交試驗(yàn)結(jié)果中,由極差R分析表明,各影響因素對(duì)綜合得分的影響大小的順序?yàn)?C>B>A>D,即時(shí)間>pH>料液比>溫度。

由表6可知,各影響因素均對(duì)其綜合得分的影響顯著,最優(yōu)組合為A2B1C1D2,即料液比1∶60、酶解pH5、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度50 ℃。由于正交試驗(yàn)中沒(méi)有該水平組合,因此在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果為,木耳多糖的α-淀粉酶抑制率為26.72%,多糖得率為32.57%,綜合評(píng)分為28.48。

表6 正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Analysis of variance of overall index score

2.7 酶解對(duì)多糖分子質(zhì)量分布的影響

采用HPGPC法檢測(cè)酶解多糖和非酶解水提多糖的分子質(zhì)量分布,如圖10、圖11所示,由于采用了示差檢測(cè)器,導(dǎo)致信號(hào)不穩(wěn),導(dǎo)致圖中的基線不是水平線,但并不影響色譜峰的觀察。以超純水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫,從信號(hào)峰的數(shù)量可以看出,非酶解水提多糖中有4種多糖組分,而酶解多糖中,多糖組分增多,尤其是非酶解水提多糖中保留時(shí)間為13 min的多糖組分可以明顯觀察到在酶解多糖中被降解為多個(gè)分子量不同的多糖組分。從圖中峰面積可以看出,圖10中各保留時(shí)間對(duì)應(yīng)各個(gè)峰的峰面積基本都小于圖11中的峰面積,這說(shuō)明與非酶解水提多糖相比酶解多糖擁有更多聚合度低的小分子多糖。以上現(xiàn)象可能是由于酶解破壞了多糖中的糖苷鍵,使多糖降解為大小不一的片段[32]。因此通過(guò)分析色譜圖可知在酶的作用下,黑木耳多糖確實(shí)發(fā)生了降解。

圖10 非酶解水提多糖分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.10 Molecular mass distribution chromatogram ofnon-enzymatic hydrolyzed polysaccharide

圖11 酶解多糖分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.11 Molecular mass distributionchromatogram of enzymolysis polysaccharide

2.8 精制黑木耳多糖的得率及降糖活性分析

利用Sevag法除去黑木耳多糖中殘留的蛋白,多糖損失率為28.74%。黑木耳多糖提取液為棕黃色,經(jīng)H2O2法脫色后,提取液顏色變?yōu)榈S色,脫色率為43.15%,多糖損失率為31.27%。

測(cè)定精制后的多糖各項(xiàng)指標(biāo),將酶解多糖的各項(xiàng)指標(biāo)與非酶解水提多糖進(jìn)行比較,結(jié)果如表7所示。

表7 多糖降糖活性及得率分析Table 7 Analysis of hypoglycemic activityand yield of polysaccharides

如表7,熱水浸提法得到的木耳多糖的α-淀粉酶抑制率、葡萄糖透析延遲指數(shù)均較低,因此判斷其降血糖性能較差。而酶法提取的多糖的α-淀粉酶抑制率、葡萄糖透析延遲指數(shù)較非酶解水提多糖有明顯的提升,這表明利用酶法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化能有效提高其生物活性,增強(qiáng)其體外降血糖能力。

因此,通過(guò)綜合分析,木耳經(jīng)酶處理后,其多糖組分進(jìn)行了生物分解與轉(zhuǎn)化,這種生物轉(zhuǎn)化能使多糖有更好的生物活性,因此在木耳多糖的應(yīng)用中,可以利用不同的生物酶進(jìn)行木耳多糖的生物轉(zhuǎn)化,并進(jìn)行分離與純化,以此獲得具有良好的生物活性的木耳多糖。

3 結(jié)論

本研究以降血糖性能與木耳多糖得率為雙指標(biāo),得到提取木耳多糖的最適復(fù)合酶體系為糖化酶、木瓜蛋白酶與果膠酶。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素與正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到的最佳提取工藝為:料液比1∶60、pH5、酶解時(shí)間為1.5 h、酶解溫度為50 ℃,此時(shí)轉(zhuǎn)化得到的木耳多糖得率為32.57%,α-淀粉酶抑制率為26.72%。對(duì)木耳粗多糖進(jìn)行脫蛋白、脫色處理后,通過(guò)酶解多糖和非酶解水提多糖的降血糖性能分析及分子量分布分析,發(fā)現(xiàn)多糖在酶的作用下發(fā)生了降解,產(chǎn)生了更多分子量不同的多糖組分,并且其α-淀粉酶抑制率為28.43%,葡萄糖透析延遲指數(shù)30 min時(shí)是34.65%,60 min時(shí)是19.21%。這表明經(jīng)酶法生物轉(zhuǎn)化的木耳多糖有很好的降血糖性能,并能保持較優(yōu)的得率,木耳多糖通過(guò)生物酶法部分降解達(dá)到了改性的作用。因此在多糖的應(yīng)用中,可以利用不同的生物酶進(jìn)行多糖的生物轉(zhuǎn)化,以此獲得具有良好的生物活性的多糖。