彭微 袁桂 劉潔 劉求梅 黃旭

412000湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，湖南 株洲

南蛇藤屬于衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，是我國(guó)重要的藥用植物，主要用于抗炎鎮(zhèn)痛、活血消腫、祛風(fēng)解毒等[1]。近年來(lái)，有關(guān)南蛇藤乙酸乙酯提取物(COE)抗腫瘤免疫機(jī)制方面的研究越來(lái)越多。大量國(guó)內(nèi)外研究表明，從中藥南蛇藤提取的有效成分COE 具有很好的抗腫瘤活性。它已被證實(shí)通過(guò)細(xì)胞毒作用、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲與增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度COE作用于胃癌細(xì)胞系MGC-803，經(jīng)24 h、48 h 培養(yǎng)后，觀察COE 對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞周期的影響，為COE 抑制胃癌的機(jī)制進(jìn)行理論上的探索，更重要的是為開(kāi)發(fā)生物利用度高的抗腫瘤新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞系MGC-803，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)試劑：①南蛇藤：西安文竹生物科技有限公司(批號(hào)071254)；②5-氟尿嘧啶：凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司；③MTT：Sigma公司；④RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清：美國(guó)GIBCO 公司；⑤二甲基亞礬：上海莼試生物技術(shù)有限公司；⑥胰蛋白酶：GIBCO 公司；⑦酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)寶特公司；⑧流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD 公司；⑨CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)NAU-RE公司。

實(shí)驗(yàn)方法：⑴藥物制備：將南蛇藤莖切斷，粉碎成粉，烘干(20 kg)，95%乙醇(150 L)加熱回流提取3 次，3 h/次，合并回收溶劑后減壓濃縮并進(jìn)行真空凍干，得到COE[3]。⑵細(xì)胞培養(yǎng)：將人胃癌MGC-803 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置37℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)含5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 傳代1 次，傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。⑶實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(不完全1640培養(yǎng)液)，南蛇藤提取物組(5、10、20、40、80、160 mg/L)，陽(yáng)性對(duì)照5-FU 組(3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)。⑷MTT法檢測(cè)南蛇藤對(duì)MGC-803 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況：①用胰蛋白酶將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞株MGC-803消化后計(jì)數(shù)，按5×104/mL 的細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)200 μL；②培養(yǎng)24 h、48 h，在每個(gè)孔內(nèi)加入現(xiàn)配置的MTT溶液5 mg/mL(20 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；③吸除各孔內(nèi)上清液，加入DMSO(150 μL/孔)，微孔板低速振蕩10 min；④選擇波長(zhǎng)450 nm，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光值(OD)；⑤計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)：IR=(1-OD 試驗(yàn)組/OD 對(duì)照組)×100%，根據(jù)寇氏改良法計(jì)算各組的IC50；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。⑸流式細(xì)胞儀檢測(cè)南蛇藤對(duì)MGC-803 細(xì)胞周期的影響：①根據(jù)MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，設(shè)置空白對(duì)照組、南蛇藤低劑量組(10 mg/L)、南蛇藤中劑量組(20 mg/L)、南蛇藤高劑量組(40 mg/L)和5-FU 組(6.25 mg/L)。②取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞MGC-803 細(xì)胞消化后，用RPMI1640培養(yǎng)液制成5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板；③繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，用胰蛋白酶消化，用PBS 洗滌細(xì)胞，離心處理，2 000 r/min，離心5 min，收集(1～5)×104 細(xì)胞；④4℃，避光PI 染色30 min；⑤流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件處理；計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

COE 對(duì)MGC-803 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24 h 后，COE 濃度在20.0 mg/L 以上的給藥試驗(yàn)組，細(xì)胞生長(zhǎng)均出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)抑制，而且抑制率隨著藥物濃度和時(shí)間的增加也逐漸升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。5-FU 組濃度在12.5 mg/L 以上各組生長(zhǎng)抑制率明顯高于對(duì)照組；培養(yǎng)48 h 后，COE 濃度在10.0 mg/L 以上各組和對(duì)照組相比，吸光度值明顯下降，抑制率逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；5-FU 濃度在 6.25 mg/L 以上 ，MGC-803 細(xì)胞受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。通過(guò)計(jì)算：IC50(COE，24 h) =lg-1[xm-i(p-0.5)]=12.781 g/L，IC50(COE，48 h) =lg-1[xm-i(p-0.5)]=8.245 g/L。見(jiàn)表1。

表1 COE對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 COE對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖的影響(±s)

注：與對(duì)照組相比，?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度(mg/L) OD值(n=6) 抑制率(%)24 h 48 h 24 h 48 h正常組 0.623±0.071 0.573±0.24 COE組(160 mg/L) 0.180±0.042?? 0.156±0.12?? 71.58 74.07 COE組(80 mg/L) 0.316±0.014?? 0.183±0.075?? 50.27 68.16 COE組(40 mg/L) 0.435±0.056?? 0.269±0.160?? 30.17 53.05 COE組(20 mg/L) 0.472±0.022?? 0.337±0.086?? 24.23 41.19 COE組(10 mg/L) 0.502±0.017?? 0.402±0.007?? 19.42 29.84 COE組(5 mg/L) 0.522±0.03 0.421±0.22 16.21 26.53 5-FU組(100 mg/L) 0.278±0.08?? 0.091±0.05?? 55.38 84.11 5-FU組(50 mg/L) 0.421±0.085?? 0.137±0.067?? 32.42 76.09 5-FU組(25 mg/L) 0.456±0.038?? 0.289±0.212?? 26.81 49.56 5-FU組(12.5 mg/L) 0.502±0.026? 0.346±0.209?? 19.42 39.62 5-FU組(6.25 mg/L) 0.526±0.075 0.397±0.239? 15.57 30.72 5-FU組(3.125 mg/L) 0.562±0.069 0.554±0.279 9.79 3.31

表2 南蛇藤對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響(±s)

表2 南蛇藤對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響(±s)

注：與正常細(xì)胞相比，?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 24 h G0/G1 S G2/M Control 53.23±2.78 20.46±3.95 17.03±1.23 COE(10 mg/L) 61.58±0.52?? 19.60±7.75 15.81±7.96 COE(20 mg/L) 68.58±2.06?? 16.52±2.50 12.81±2.88 COE(40 mg/L) 77.92±3.79?? 13.32±2.99? 8.41±4.11??5-FU(6.25 mg/L) 61.06±1.68? 27.98±5.77?? 10.41±2.73?

表3 南蛇藤對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響(±s)

表3 南蛇藤對(duì)MGC-803細(xì)胞周期的影響(±s)

注：與正常細(xì)胞相比，?P＜0.05，??P＜0.01。

組別 48 h G0/G1 S G2/M Control 54.62±1.42 22.98±0.16 20.03±1.53 COE(10 mg/L) 58.58±1.73?? 19.98±6.63 18.31±4.77 COE(20 mg/L) 71.58±3.01?? 17.52±3.53 9.01±3.82??COE(40 mg/L) 80.01±4.14?? 7.62±1.62?? 8.41±4.11??5-FU(6.25 mg/L) 63.06±1.46?? 32.91±2.71?? 4.50±3.60?

COE 對(duì)MGC-803 細(xì)胞周期的影響：MGC-803 細(xì)胞經(jīng)南蛇藤COE(10、20、40 mg/L)和5-FU(6.25 mg/L)處理24 h、48 h 后，細(xì)胞周期均發(fā)生了明顯改變。24 h后GO/G1期細(xì)胞分別增加至(61.58±0.52)、(68.58±2.06)、(77.92±3.79)；48 h后細(xì)胞分別增加至(58.58 ± 1.73)、(71.58±3.01)、(80.01±4.14)，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度升高而不斷增多，COE 濃度低于20 mg/L 以下時(shí)，對(duì)S 期和G2/M 期細(xì)胞數(shù)影響不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)濃度增加到40 mg/L時(shí)，S 期和G2/M 期細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；6.25 mg/L 5-FU溶液能使停在G0/G1期和S期的細(xì)胞所占比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2～3。

討 論

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于其臨床癥狀缺乏特異性，大多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于晚期。目前，主要的治療手段仍然是外科治療。中藥治療惡性腫瘤不良反應(yīng)小，能提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。因此，尋找低毒、高效的天然植物成分，是目前研究的主要方向。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者從調(diào)節(jié)通路、腫瘤微環(huán)境、重要蛋白的表達(dá)等多方面證實(shí)COE 具有顯著的抗腫瘤活性[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT 比色實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)南蛇藤對(duì)人胃癌MGC-803 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COE 可呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖，濃度在10 mg/L 以上時(shí)對(duì)MGC-803 細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。細(xì)胞周期阻滯是藥物抑制細(xì)胞增殖的重要方式之一[5]。本研究中，經(jīng)10、20、40 mg/L COE作用于MGC-803，24 h、48 h 后，細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果表明，COE 組G0/G1期的細(xì)胞比例顯著增加，S 期和G2/M 期細(xì)胞比例降低，提示COE可以將MGC-803細(xì)胞阻滯在G0/G1期。結(jié)合細(xì)胞增殖情況分析，COE 能抑制MGC-803 細(xì)胞增殖的重要原因就是通過(guò)誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞周期阻滯來(lái)減緩細(xì)胞的增殖速度，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。5-FU是一種抑制腫瘤細(xì)胞S 期的特異性藥物，轉(zhuǎn)化成的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，抑制DNA 合成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡和周期停滯[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-FU組對(duì)G0/G1期和S期細(xì)胞均有一定作用，細(xì)胞所占比例隨時(shí)間增加而增加，尤其是S期增加顯著。

綜上所述，COE 可以抑制胃癌MGC-803 細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S 期，從而干擾細(xì)胞的周期進(jìn)程。研究COE 抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，為COE 抗腫瘤機(jī)制提供了新的研究思路，也為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。