董智慧 呂菊 謝鵬 任真奎,3 官志忠,4 禹文峰

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3黔西南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科；4貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室)

在神經(jīng)退行性疾病中，阿爾茨海默病(AD)是現(xiàn)在公共衛(wèi)生最重視的問題之一。AD是一種由多種因素如性別、遺傳基因、環(huán)境等影響的神經(jīng)退行性疾病，主要特征在于β淀粉樣蛋白(Aβ)和tau蛋白的異常加工，導(dǎo)致細(xì)胞外老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，從而引發(fā)一系列細(xì)胞毒性作用，最終導(dǎo)致大腦神經(jīng)元凋亡，甚至壞死，繼而出現(xiàn)漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙〔1〕。熱休克蛋白(HSP)70是HSPs家族中含量最多的成員，可以通過增強(qiáng)β淀粉樣蛋白(Aβ)清除、抑制Aβ聚集、恢復(fù)和穩(wěn)定tau蛋白的穩(wěn)定性及抑制細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥等多種方式在AD中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用〔2,3〕。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，過表達(dá)HSP70可減輕脂多糖(LPS)或α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥〔4,5〕。α7尼古丁膽堿能受體(α7nAChR)廣泛存在于大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中，在AD中具有神經(jīng)保護(hù)作用而成為AD的重要研究對(duì)象〔6〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)和生存中具有重要作用。在AD中，α7nAChR可通過PI3k/Akt信號(hào)通路參與AD的神經(jīng)保護(hù)作用〔7〕。同時(shí)，有研究表明，PI3K/Akt也參與了HSP70 的調(diào)控〔8〕。但是對(duì)于α7nAChR是否參與了HSP70的調(diào)控目前還不清楚。本課題組前期研究表明在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，尼古丁可通過α7nAChRs調(diào)控內(nèi)源性cryab蛋白的表達(dá)〔9〕。而HSP70與cryab都屬于HSPs家族的成員，他們都具有清除蛋白異常聚集的功能。本研究擬探討在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)α7nAChR與HSP70蛋白表達(dá)的關(guān)系，為AD的預(yù)防提供新思路。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～24 h內(nèi)新生的Sprangue-Dawley(SD)大鼠，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0004)。

1.2主要儀器和試劑 胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司(美國(guó))；尼古丁及鼠抗HSP70單克隆抗體，購(gòu)于Sigma公司；α7nAChR阻斷劑methyllycaconitine(MLA)，購(gòu)于TOXICE公司；PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑LY294002，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠的二抗和鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(actin )單克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)CST公司；超敏電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒和聚乙烯二氟(PVDF)膜購(gòu)于美國(guó)Millipore 公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白Marker購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；抗體稀釋液、封閉液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)快速凝膠配置試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光倒置顯微鏡出自O(shè)lympus公司；超高速離心機(jī)出自德國(guó)的eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于日本SANYO公司。

1.3原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定方法 主要參照McCarthy等〔10〕和Schildge等〔11〕的方法并進(jìn)行改良，分離新生SD乳鼠大腦皮質(zhì)處的星形膠質(zhì)細(xì)胞，剪成約1 cm3，0.25%胰酶消化并進(jìn)行漂洗后，加入含1 %雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)及含10 %FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)吹打制成細(xì)胞懸液后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在5% CO2、37℃恒溫的條件下培養(yǎng)24 h后換液。之后每隔2～3 d換液一次直到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶底。純化后將細(xì)胞傳1～3代。將細(xì)胞接種于用多聚賴氨酸(PLL)包被好的12孔板內(nèi)，采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及神經(jīng)核抗原(Neu)N進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光雙染后鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度。

1.4細(xì)胞分組及加藥處理 當(dāng)分離出星形膠質(zhì)細(xì)胞后培養(yǎng)1 w，純化并鑒定后，以一定密度接種于六孔板內(nèi)，待細(xì)胞快長(zhǎng)滿孔底時(shí)，將細(xì)胞分組后加藥處理。細(xì)胞分組情況：?jiǎn)为?dú)空白對(duì)照組、單獨(dú)激動(dòng)劑尼古丁組、單獨(dú)阻斷劑(MLA或LY294002)組、MLA+尼古丁組、PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY294002組及LY294002+尼古丁組。MLA+尼古丁組或LY294002+尼古丁組預(yù)先加MLA或LY294002處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h后，再加入尼古丁共同處理18 h。

1.5免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)將殘留培養(yǎng)液清洗干凈，加入適量細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，冰上裂解2 h后12 000 r/min離心20 min，收集上清。通過BCA蛋白定量法檢測(cè)提取的細(xì)胞蛋白濃度。最后，采用免疫印跡法檢測(cè)目的蛋白HSP70和P-Akt蛋白表達(dá)水平，以內(nèi)參(β-actin/GAPDH)蛋白為內(nèi)對(duì)照。用ImageJ軟件分析并計(jì)算HSP70和P-Akt蛋白條帶與β-actin/GAPDH蛋白條帶像素灰度的比值作為蛋白表達(dá)相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3復(fù)孔。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行分析，組間兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定 熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞占所有細(xì)胞的98%以上時(shí)，繼續(xù)開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞 GFAP 免疫熒光染色(×200)

2.2尼古丁明顯上調(diào)HSP70蛋白表達(dá)水平 與空白對(duì)照組〔(1.00±0.27)%〕比較，用濃度為5 μmol/L的尼古丁刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間段(6、12、18、24 h)后，HSP70蛋白表達(dá)水平不同程度升高〔分別為(1.89±0.25)%、(2.55±0.52)%、(4.16±0.67)%、(4.06±0.77)%，P<0.05〕，在18 h、24 h時(shí)間段升高最明顯(P<0.01)。見圖2。

圖2 尼古丁上調(diào) HSP70 蛋白表達(dá)

2.3尼古丁通過激活α7nAChRs上調(diào)HSP70蛋白表達(dá)水平 采用濃度為0.1 μmol/L的α7nAChRs 阻斷劑MLA預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h后，再加入濃度為5 μmol/L尼古丁共培養(yǎng)18 h后檢測(cè)HSP70蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，對(duì)照組、MLA組、尼古丁組、MLA+尼古丁組HSP70蛋白水平分別為(1.00±0.17)%，(1.12±0.17)%，(2.08±0.18)%，(1.19±0.12)%；MLA+尼古丁組與尼古丁組比較，HSP70蛋白表達(dá)水平受到抑制(P<0.05)。證明尼古丁可以通過激活α7nAChRs 而上調(diào)HSP70蛋白水平。見圖3。

圖3 尼古丁通過激活 α7nAChRs上調(diào)HSP70 蛋白表達(dá)

2.4PI3K/Akt信號(hào)通路參與尼古丁激活α7nAChRs上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白表達(dá)水平 用5 μmol/L 尼古丁分別作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間(5 min、10 min、20 min、30 min)，結(jié)果顯示P-Akt蛋白的上調(diào)效應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間依賴性，對(duì)照組，5、10、20、30 min組P-Akt蛋白水平依次為(1.00±0.28)%、(1.00±0.35)%、(1.47±0.27)%、(2.33±0.42)%、(2.21±0.33)%；在20 min后蛋白表達(dá)達(dá)到穩(wěn)定階段，因此選用該時(shí)間段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(P<0.05)，見圖4。后續(xù)采用LY294002或MLA預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h,再加入尼古丁共處理20 min后提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組、尼古丁組、尼古丁+LY294002組、MLA+尼古丁組的P-Akt蛋白水平分別為(1.00±0.15)%、(1.93±0.19)%、(1.35±0.27)%、(0.86±0.20)%，P-Akt蛋白的上調(diào)作用可被LY294002或MLA所抑制(P<0.05)，見圖5，圖6。為進(jìn)一步研究LY294002是否能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞HSP70的上調(diào)，用10 μmol/L的LY294002預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h，在加入尼古丁5 μmol/L 培養(yǎng)18 h后，對(duì)照組、LY294002組、尼古丁組、尼古丁+LY294002組HSP70蛋白表達(dá)水平分別為(1.00±0.17)%、(1.07±0.23)%、(1.77±0.14)%、(1.09±0.13)%；與尼古丁組比較，HSP70蛋白表達(dá)水平明顯受到抑制(P<0.05)，見圖7。

圖4 尼古丁顯著上調(diào) P-Akt(ser473)蛋白表達(dá)

圖5 LY294002對(duì)P-Akt蛋白表達(dá)的影響

圖6 MLA對(duì)P-Akt蛋白表達(dá)的影響

圖7 LY294002對(duì)尼古丁上調(diào)HSP70蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

HSP是機(jī)體在受到外界刺激(如高溫，重金屬，有毒物質(zhì)等)時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的一種高度保守的分子伴侶蛋白。HSP在蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞可以將HSP轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸和軸突以阻斷或阻礙錯(cuò)誤折疊蛋白的過程〔12〕。AD的病理機(jī)制主要是Aβ的異常折疊、聚集和tau蛋白的過度磷酸化。許多研究表明，HSP不僅可以直接抑制β-淀粉樣聚集，保護(hù)細(xì)胞免受Aβ毒性的影響，也可以促進(jìn)錯(cuò)誤聚集和折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化和降解。HSP70是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富的一種HSP，HSP70家族由17個(gè)成員組成，在細(xì)胞的各區(qū)室廣泛存在，包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。HSP70也具有保護(hù)蛋白質(zhì)正確折疊的功能，并有助于損傷蛋白質(zhì)的再折疊和再活化〔13〕。在神經(jīng)退行性疾病中，HSP70與Aβ和路易小體有共存的現(xiàn)象。在AD腦組織中，也發(fā)現(xiàn)受影響區(qū)域中HSP70的高水平表達(dá)〔14〕。HSP70過表達(dá)在AD中具有神經(jīng)保護(hù)作用。在AD動(dòng)物模型APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦中，過表達(dá)HSP70改善了小鼠的認(rèn)知功能障礙，減輕了AD相關(guān)表型〔15,16〕。HSP70可以與APP結(jié)合并干擾其分泌途徑以減少Aβ的形成，通過蛋白酶體系統(tǒng)降解tau和Aβ寡聚體〔17〕，也可直接結(jié)合異常tau蛋白，并通過促進(jìn)tau蛋白的降解和去磷酸化來降低其濃度〔14〕。外源性的HSP70對(duì)Aβ42的細(xì)胞外沉積誘導(dǎo)的毒性具有高度保護(hù)作用〔18〕。此外，在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，過表達(dá)HSP70可以抑制α-突觸核蛋白或LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥〔4,5〕。

α7nAChR是配體門控離子通道家族中的成員，在調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、提高學(xué)習(xí)和記憶能力及增強(qiáng)認(rèn)知功能中起重要作用〔6〕。在神經(jīng)退行性疾病中，α7nAChRs表達(dá)顯著降低〔19〕。在AD動(dòng)物模型中，激動(dòng) α7nAChR會(huì)對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力產(chǎn)生影響。而α7nAChR在 AD 及精神分裂患者的治療中，也可明顯改善患者的認(rèn)知功能障礙〔20〕。此外，有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了神經(jīng)保護(hù)作用，在AD的海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Akt表達(dá)明顯減少，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔21〕。同時(shí)，α7nAChR參與了P13K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控，激活α7nAChR可使PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt被激活，活化的Akt可使GSK-3β第9位點(diǎn)處的絲氨酸磷酸化(Ser9)水平升高，從而抑制GSK-3β活化導(dǎo)致的tau蛋白病變〔19〕。PI3K/Akt信號(hào)通路參與了誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)可能依賴于Akt激活后抑制了GSK-3β的活性。GSK-3β的抑制可使HSP70表達(dá)上調(diào)，阻斷PI3K/Akt通路會(huì)激活GSK-3β的活性，從而抑制HSP70的表達(dá)〔22,23〕。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，用尼古丁處理原代星形膠質(zhì)細(xì)胞能顯著上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中P-Akt蛋白表達(dá)水平，而該上調(diào)作用可以被該通路的抑制劑LY294002 或α7nAChR的阻斷劑MLA 所抑制。這說明尼古丁可以通過激活α7nAChR，使PI3K/Akt信號(hào)通路激活引起細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化。該研究結(jié)果與前期結(jié)果〔9〕相一致。另外，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制HSP70蛋白的表達(dá)。本文進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，使用PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑LY294002能顯著降低HSP70的表達(dá)水平，說明尼古丁很有可能通過激活α7nAChRs從而激活PI3K/Akt/HSP70信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)AD的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究HSP70蛋白是否可作為AD的一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。