盧珍華，郭彩華，葉 鵬，陳昭華，翁武銀，江興龍

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn) 檢疫技術(shù)中心，福建廈門 361026；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021)

花鰻鱺(Anguillamarmorata)屬鰻鱺目鰻鱺科鰻鱺屬，又稱蘆鰻、雪鰻。目前，花鰻鱺的研究主要集中在花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)特征，養(yǎng)殖技術(shù)，花鰻鱺的營養(yǎng)成分及營養(yǎng)價(jià)值分析，從基因水平對花鰻鱺的研究等方面[1-5]，而有關(guān)花鰻鱺魚皮膠原蛋白的研究卻未見報(bào)道。本研究以養(yǎng)殖花鰻鱺為原料，從魚皮中提取膠原蛋白，分析膠原蛋白的理化性質(zhì)及體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性，為花鰻鱺膠原蛋白在功能性食品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花鰻鱺由集美大學(xué)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心合作的福建龍巖市某養(yǎng)殖場提供。取樣時(shí)間2017年4—6月，共采集花鰻鱺樣品6尾，平均個(gè)體重量(1 960±50)g，體長(85.4±2.6)cm。

十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、DC蛋白試劑盒為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇(HPLC級)為美國INC公司產(chǎn)品；三氟乙酸(HPLC級)為美國Amresco公司產(chǎn)品；磷酸鹽和胃蛋白酶(1 200 U/g)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)R-250為國產(chǎn)生物試劑；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Mini-PⅢ垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；G:Box凝膠成像儀(英國Syngene公司)；L-8900高效氨基酸分析儀(日本HITACHI公司)；UV-2600A紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；Nicolet iS10傅里葉紅外變化光譜儀(美國Thermo公司)；FE20K pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；烏氏粘度計(jì)(上海玻璃儀器一廠)；E-1010離子濺射儀、S-4800電子掃描顯微鏡(日本東京日立制造所)；DHR流變儀(美國TA公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取

參考Tang等[6]的方法在4 ℃下提取花鰻鱺魚皮膠原蛋白?；狑~魚皮先利用0.1 mol/L NaOH浸泡36 h后，用冰水漂洗至中性，再利用10%(V/V)的正丁醇溶液浸泡24 h，冰水漂洗，再用25%(V/V)乙醇浸泡24 h，冰水漂洗后，以1∶30(W/V)的比例將魚皮浸泡于含1%(W/V)胃蛋白酶的0.5 mol/L 乙酸溶液中浸提3 d。浸提液通過離心(15 000g,20 min)，獲得的上清液利用透析袋(10 kDa)和0.02 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析48 h，再用0.5 mol/L乙酸溶解，加入終濃度為2.3 mol/L NaCl使膠原鹽析沉淀，通過離心(15 000g,20 min)收集沉淀，再用0.5 mol/L乙酸溶解沉淀，分別利用0.1 mol/L乙酸和蒸餾水進(jìn)行透析，通過冷凍干燥獲得白色、蓬松、海綿狀的花鰻鱺魚皮膠原蛋白，-30 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 膠原蛋白理化性質(zhì)研究

1.3.2.1 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Laemmli[7]報(bào)道的方法進(jìn)行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis)電泳。凍干的花鰻鱺魚皮膠原蛋白利用蛋白質(zhì)變性劑[20 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L 尿素、2%(W/V)SDS，pH 8.8]溶解，15 000g離心20 min收集上清液，用Lowry等[8]的方法測定蛋白含量。

所用的濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%(W/V)和6%(W/V)，上膠樣品的蛋白濃度為1 mg/mL，采用恒流電泳，電流8 mA。電泳后的凝膠，先用0.025%(W/V)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，再用脫色液(由甲醇∶乙酸∶重蒸水=1∶3∶7混合而成)脫色至背景清晰，利用G:Box凝膠成像儀拍照。電泳所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量10 000～200 000。

1.3.2.2 氨基酸組成

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的氨基酸組成利用L-8900高效氨基酸分析儀測定。稱取適量凍干魚皮膠原蛋白于消化管中，加入含0.1%(W/V)苯酚的6 mol/L HCl溶液，抽真空充氮?dú)饷芊?，?10 ℃條件下水解22 h。酸水解后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除鹽酸，殘留物溶解在0.02 mol/L HCl中，過0.22 μm水系濾膜，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定酸水解液中氨基酸的組分。氨基酸含量以外標(biāo)法確定。參照文獻(xiàn)[6]，氨基酸組成采用每1 000個(gè)氨基酸殘基中某種氨基酸殘基數(shù)表示，形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.3 紫外吸收光譜

取適量凍干花鰻鱺魚皮膠原蛋白溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，調(diào)配成濃度為1 mg/mL的魚皮膠原蛋白溶液。以0.1 mol/L乙酸溶液作為空白對照液，利用UV-2600A紫外分光光度計(jì)在200～400 nm紫外區(qū)段對1 mg/mL的魚皮膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描。

1.3.2.4 傅里葉變換紅外光譜

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析，利用Nicolet iS10傅里葉紅外變化光譜儀在室溫下實(shí)施。分別稱取1 mg凍干的花鰻鱺魚皮膠原蛋白和100 mg溴化鉀(KBr)，混合后充分研磨，研磨好的粉末置于壓片機(jī)中壓成透明薄片。以溴化鉀薄片為空白對照。掃描波數(shù)取4000～400 cm-1，光譜分辨率設(shè)定為4 cm-1，掃描32次。

1.3.2.5 粘度和熱變性分析

借鑒Nagai等[9]的方法并做一定的修改后測定花鰻鱺魚皮膠原蛋白的粘度。凍干的魚皮膠原蛋白用0.1 mol/L乙酸溶液溶解成1%(W/V)的膠原蛋白溶液，在10～45 ℃下測定花鰻鱺魚皮膠原蛋白通過毛細(xì)管所需的時(shí)間，每個(gè)溫度點(diǎn)的重復(fù)測定次數(shù)是5次。特性粘度ηsp按公式(1)計(jì)算，比濃粘度ηre按公式(2)的計(jì)算。

(1)

(2)

式中：t為花鰻鱺魚皮膠原蛋白溶液通過毛細(xì)管所需的時(shí)間，t0為0.1 mol/L乙酸溶液通過毛細(xì)管所需的時(shí)間；c為1%(W/V)。比濃粘度ηre用L表示，即單位濃度下單個(gè)分子對溶液粘度的貢獻(xiàn)。

以溫度為橫坐標(biāo)，比濃粘度ηre為縱坐標(biāo)，做花鰻鱺魚皮膠原蛋白的熱變性曲線。當(dāng)比濃粘度ηre為最大比濃粘度一半時(shí)所對應(yīng)的溫度就是花鰻鱺魚皮膠原蛋白的熱變性溫度，用Td(thermal denaturation)表示。

1.3.3 膠原蛋白自組裝特性

根據(jù)Zhang等[10]報(bào)道的方法，將凍干的魚皮膠原蛋白溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，配制成濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液，然后放在pH 7.2緩沖液(0.15 mol/L NaCl、0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L 檸檬酸)進(jìn)行透析24 h。透析好的膠原溶液放在水浴25 ℃下保溫使膠原自組裝形成纖維。

1.3.3.1 濁度

在膠原自組裝過程中，利用UV-2600A紫外分光光度計(jì)間隔2 min測花鰻鱺魚皮膠原蛋白在313 nm處的動(dòng)態(tài)吸光值，繪制濁度曲線。

1.3.3.2 掃描電鏡觀察

將自組裝形成的膠原膠體置于pH 7.4含2.5%(V/V)戊二醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中固定1 d，用pH 7.4的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗后，再利用不同濃度的乙醇(30%～100%，由低到高)梯度脫水，經(jīng)CO2臨界點(diǎn)干燥，E-1010離子濺射儀鍍金處理，再用S-4800電子掃描顯微鏡觀察拍照記錄。

1.3.3.3 動(dòng)態(tài)黏彈性

pH 7.2緩沖液透析完成的膠原蛋白溶液根據(jù)趙燕等[11]報(bào)道的方法測定該膠原蛋白溶液的彈性模量值(G’)和黏性模量值(G”)，繪制黏彈模量隨時(shí)間變化的曲線。測定條件：φ40 mm標(biāo)準(zhǔn)鋁材質(zhì)平板模具；控制間隙：1 mm；測定溫度：25 ℃；掃描模式：時(shí)間掃描；掃描時(shí)長：90 min。形變率：1%；頻率：1 Hz。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

花鰻鱺魚皮經(jīng)堿除雜蛋白、正丁醇脫脂、胃蛋白酶及乙酸抽提處理、透析和干燥后得到花鰻鱺魚皮膠原蛋白。該膠原蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 花鰻鱺魚皮膠原蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of the collagen from A.marmorata skins M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；C：花鰻鱺魚皮膠原蛋白

在SDS-PAGE圖譜中，花鰻鱺魚皮膠原蛋白至少有5條條帶出現(xiàn)，分別為α1、α2、α3、β和γ。α1的分子量約為118 kDa；α2的分子量比α1的小，其條帶也比α1淺，表明α1是花鰻鱺魚皮膠原蛋白的主要成分；有α3肽鏈存在，分子量比α1的小比α2的大。β條帶的分子量在200 kDa以上，推測認(rèn)為是α1鏈的二聚體；α3和γ的濃度值均低。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，認(rèn)為花鰻鱺魚皮膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，標(biāo)記為[α1(I)]2α2(Ⅰ)。

2.2 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的氨基酸組成

花鰻鱺魚皮膠原蛋白經(jīng)酸水解后得到的氨基酸組成如表1。由表1可見，花鰻鱺魚皮膠原蛋白含有豐富的Gly，約占總氨基酸數(shù)的1/3，Pro含量為11.2%，Hyp含量為7.67%，三者的比值約為8∶3∶2，符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)。膠原蛋白中占比大的氨基酸依次是Gly、Ala、Hyr、Glu和Pro，含量最小的是胱氨酸，沒有檢測到羥賴氨酸。

表1 花鰻鱺魚皮膠原蛋白氨基酸組成Tab.1 Amino acid compositions of collagen from A.marmorata skins ‰

2.3 紫外吸收光譜特性

紫外光譜的作用主要是考察研究對象中是否存在共軛體系?；狑~魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖見圖2。從圖2可以看到，花鰻鱺魚皮膠原蛋白在200～400 nm紫外區(qū)段有吸收峰，說明該膠原蛋白分子中存在共軛體系，其最大吸收波長為222.6 nm。

2.4 傅里葉變換紅外光譜特性

紅外光譜能測定有機(jī)化合物在紅外區(qū)域波長的光照射下的吸收情況，有機(jī)物中不同的基團(tuán)在不同波長處有特征的吸收峰，所以借助于紅外光譜的測定，通過分析紅外譜圖中波數(shù)4 000～1 300 cm-1區(qū)域中的吸收峰，可以推測該化合物中存在哪些官能團(tuán)?；狑~魚皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖見圖3。

圖2 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of collagen from A.marmorata skins

圖3 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of collagen from A.marmorata skins

根據(jù)圖3，該膠原蛋白的紅外光譜特征吸收峰為酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。酰胺A的吸收峰在3 307 cm-1處，酰胺B的吸收峰在2 930 cm-1處，酰胺I的吸收峰在1 652 cm-1處，酰胺Ⅱ的吸收峰在1 548 cm-1處，酰胺Ⅲ的吸收峰在1 238 cm-1處。酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰的存在說明所提取的花鰻鱺膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均沒有被破壞。所提取的花鰻鱺膠原蛋白是經(jīng)胃蛋白酶處理酸溶得到的膠原蛋白，傅里葉紅外光譜結(jié)果表明膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶處理后三股螺旋結(jié)構(gòu)還存在。

2.5 粘度和熱變性特性

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的比濃粘度ηre值隨溫度上升的變化趨勢見圖4。溫度值在25 ℃之前比濃粘度ηre值變化小，可視作是穩(wěn)定態(tài)；25～35 ℃比濃粘度ηre值急劇下降；當(dāng)溫度值達(dá)35 ℃時(shí)比濃粘度ηre值就很小了，35～45 ℃變化不大。

圖4 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的熱變性曲線Fig.4 Thermal denaturation curve of collagen from A.marmorata skins

根據(jù)圖4花鰻鱺魚皮膠原蛋白的熱變性曲線，可以獲得Td為28 ℃，這表示花鰻鱺魚皮膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)在超過28 ℃后螺旋的穩(wěn)定性會下降。

2.6 體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的濁度測定結(jié)果見圖5。通過分析該濁度-時(shí)間曲線，可以發(fā)現(xiàn)該膠原蛋白的纖維形成過程的特點(diǎn)是：在25 ℃下保溫的前6 min內(nèi)，濁度值變化小，酸溶性膠原蛋白ASC的A313 nm平均值為0.134，是成纖維過程的遲滯期；隨后A313 nm值增加，10～20 min濁度值迅速上升，是成纖維過程的成長期；26 min后漸漸進(jìn)入穩(wěn)定態(tài)，34 min時(shí)進(jìn)入成纖維的平穩(wěn)期，ASC的A313 nm平均值為1.476。

圖5 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的濁度-時(shí)間曲線Fig.5 Turbidity-time curves of collagen from A.marmorata skins

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的動(dòng)態(tài)黏彈性測定結(jié)果見圖6。分析該流變彈性和黏性模量曲線，可以看出，隨著組裝時(shí)間的延長，膠原蛋白的模量(彈性模量和黏性模量)值展現(xiàn)出與濁度曲線相似的演變行為，即在組裝初期，模量值較低，隨后進(jìn)入模量值的增長階段并最終達(dá)到平衡。組裝初期膠原溶液的黏性模量G”(loss modulus)大于彈性模量G’(storage modulus)，這可以解釋成此時(shí)的膠原是以液體狀態(tài)存在，隨著時(shí)間的延長，彈性模量G’的增加速率大于黏性模量G”，在大約7 min時(shí)，兩者出現(xiàn)交匯點(diǎn)即凝膠點(diǎn)，交匯點(diǎn)彈性模量G’為0.091 Pa。之后彈性模量值快速上升，膠原分子有序地聚集形成凝膠纖維，經(jīng)過約30 min的增長期后，花鰻鱺膠原蛋白形成膠原凝膠纖維的速度進(jìn)入了穩(wěn)定期，第一個(gè)平衡點(diǎn)(37 min)的彈性模量G’為62.64 Pa。

圖6 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的流變彈性和黏性模量曲線Fig.6 The storage modulus(G’)and loss modulus(G”)for self-assembling of collagen from A.marmorata skins

2.7 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

從圖7可以發(fā)現(xiàn)，花鰻鱺膠原蛋白自組裝后出現(xiàn)纖維結(jié)構(gòu)，5 000倍和50 000倍的視野里，凝膠呈網(wǎng)狀的交錯(cuò)條紋纖維結(jié)構(gòu)。在100 000倍的視野里，通過SEM(scanning electron microscope)自帶軟件計(jì)算出花鰻鱺膠原凝膠纖維的直徑主要集中在48.3～74.6 nm。

3 討論

3.1 花鰻鱺魚皮膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果的解析

Weng等[14]在研究金鯧魚魚皮膠原蛋白的亞基結(jié)構(gòu)特征時(shí)指出α1肽鏈的分子量比α2肽鏈的高，但等電點(diǎn)比α2肽鏈的低，而且魚種間的氨基酸序列差異比α2肽鏈的更明顯。Veeruraj等[12]認(rèn)為海鰻魚皮中有α3肽鏈存在，分子量比α1的小比α2的大；α3與α1以共同存在的形式出現(xiàn)，不易分離。朱圣庚等[15]認(rèn)為Ⅰ型膠原蛋白是在骨、皮膚、腱和角膜中占優(yōu)勢的膠原蛋白，由2條相同的α1(Ⅰ)肽鏈和1條α2(Ⅰ)肽鏈構(gòu)成。根據(jù)這些學(xué)者的觀點(diǎn)，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果，認(rèn)為推定花鰻鱺魚皮膠原蛋白屬于I型膠原蛋白是正確的。

圖7 花鰻鱺魚皮膠原蛋白纖維SEM圖Fig.7 SEM pictures of collagen from A.marmorata skins

3.2 花鰻鱺魚皮膠原蛋白氨基酸組成與其他鰻魚皮膠原蛋白氨基酸組成的比較

與Veeruraj等[12]報(bào)道的提自海鰻魚皮的酸溶性膠原蛋白(ASC)的氨基酸組成和鴻巢章二等[13]介紹的七鰓鰻膠原蛋白的氨基酸組成相比，膠原蛋白中占比最大的氨基酸有相似性，如Gly、Ala、Hyr、Pro；但含量較少的氨基酸有一些差異，如七鰓鰻中沒有檢測到胱氨酸，而花鰻鱺膠原蛋白中檢測出有胱氨酸，海鰻ASC中檢測出有半胱氨酸(Cys)。溫慧芳等[16]在研究不同提取方法提取所得到鮰魚皮膠原蛋白氨基酸組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的1 000個(gè)氨基酸殘基中分別小于0.1個(gè)和0.5個(gè)Cys。而張強(qiáng)等[17]在研究鰱魚皮膠原蛋白的提取方法時(shí)，不論是酸法或是酶法或是熱水浸提法提取的鰱魚皮膠原蛋白均沒有檢測到Cys。由此可見不同來源不同方法提取的膠原蛋白是否有Cys，是一個(gè)值得探究的問題。

3.3 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖分析

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的最大紫外吸收峰所對應(yīng)的波長是222.6 nm。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的最大紫外吸收峰會出現(xiàn)在280 nm處。花鰻鱺魚皮膠原蛋白的吸收峰為什么沒有出現(xiàn)在280 nm？分析原因，在280 nm處才有強(qiáng)力紫外吸收的氨基酸是色氨酸，可膠原蛋白中幾乎不含色氨酸[17]。膠原蛋白中貢獻(xiàn)苯環(huán)共軛π體系的氨基酸是Phe和Tyr，它們的最大光吸收波長分別是257和275 nm[15]，Phe和Tyr在花鰻鱺膠原蛋白中的含量分別為18個(gè)和10個(gè)/1 000個(gè)氨基酸殘基中。另外肽鍵的-C=O、-CONH2或與膠原螺旋構(gòu)象有關(guān)的次級鍵也可以組成共軛體系，在210～250 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰[16]。使花鰻鱺魚皮膠原蛋白最大吸收波長處在222.6 nm的另一個(gè)重要原因是溶劑(本次實(shí)驗(yàn)所用的溶劑是乙酸)，溶劑會影響吸收峰的位置，乙酸是極性溶劑，會影響π電子躍遷所需的能量[18]，我們通過Tyr標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑級)溶于乙酸后上機(jī)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了乙酸確實(shí)使Tyr的最大光吸收波長向短波方向移動(dòng)了一些。

3.4 花鰻鱺魚皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜圖分析

花鰻鱺魚皮膠原蛋白的紅外光譜圖中含有酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰，與Heu等[19]所報(bào)道的比目魚魚皮膠原蛋白和Veeruraj等[12]報(bào)道的海鰻魚皮的ASC的紅外光譜結(jié)果類似。酰胺A是肽鏈中N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，其峰形比較尖，波數(shù)范圍通常是3 440～3 400 cm-1，當(dāng)N-H參與氫鍵形成時(shí)，吸收峰會向低波數(shù)移動(dòng)一些[20]。酰胺B為-CH2-的不對稱伸縮振動(dòng)峰[21]。酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰被認(rèn)為與多肽鏈的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[19]。酰胺Ⅰ是酰胺鍵中的-C=O伸縮振動(dòng)峰，這是多肽鏈二級結(jié)構(gòu)存在的敏感標(biāo)志[22]，酰胺Ⅱ是酰胺鍵中的N-H和C-N的彎曲振動(dòng)所產(chǎn)生的，酰胺Ⅲ是Gly殘基和Pro殘基中的-CH2所產(chǎn)生的振動(dòng)峰。當(dāng)酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰同時(shí)存在時(shí)說明膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均沒有被破壞。

3.5 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的熱變性特性分析

本研究表明膠原蛋白的Td是28 ℃，雖然這是一個(gè)體外研究結(jié)果，但對養(yǎng)殖花鰻鱺的水溫控制有一定的指導(dǎo)意義。朱陳平[23]認(rèn)為養(yǎng)殖花鰻鱺時(shí)投食量與養(yǎng)殖池的水溫有關(guān)，水溫24～29 ℃花鰻鱺的食量較大，超過30 ℃后食量變小。鴻巢章二等[13]認(rèn)為膠原的熱穩(wěn)定性與全部亞氨基酸(Pro+Hyp)，尤其是含量之間存在著正的相關(guān)性，因?yàn)閬啺被岬倪量┉h(huán)對二級結(jié)構(gòu)所起的固定化以及Hyp的羥基所形成的氫鍵對膠原螺旋的穩(wěn)定性起著大的作用。Veeruraj等[12]報(bào)道的海鰻魚皮ASC膠原蛋白的Td為38.5 ℃，亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(96+94)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為3∶1∶1；張強(qiáng)等[17]報(bào)道的鰱魚皮ASC的Td為31 ℃，亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(128+65)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為5∶2∶1；花鰻鱺魚皮膠原蛋白的亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(112+76)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為8∶3∶2?；狑~魚皮膠原蛋白的熱變性溫度Td比海鰻魚皮膠原蛋白和鰱魚皮膠原蛋白的都低，而它們?nèi)叩膩啺被峥偭慷荚?90/1 000左右，所以膠原的熱穩(wěn)定性，除了與全部亞氨基酸含量有相關(guān)性外，應(yīng)該與膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)關(guān)系密切的Gly∶Pro∶Hyp比值也有關(guān)，因?yàn)槎嚯逆満荛L區(qū)段是由Gly-x-y氨基酸序列重復(fù)而成的[15]。

3.6 體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性分析

分析花鰻鱺魚皮膠原蛋白的濁度曲線和流變黏彈性模量曲線的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)花鰻鱺魚皮膠原蛋白的體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性表現(xiàn)為典型的3階段模式，即遲滯期、成長期和穩(wěn)定期。這與Comper等[24]報(bào)道的膠原纖維體外成核模式，以及趙燕等[11]描述的草魚和烏鱧魚皮膠原的自組裝特征有相似之處。盡管花鰻鱺的生活史有在深海中產(chǎn)卵孵化這個(gè)特點(diǎn)，但它的生長成熟是在淡水中完成的，所以它的膠原自組裝特征與淡水魚魚皮膠原的相似是能理解的。

3.7 花鰻鱺魚皮膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

在5 000倍和50 000倍的視野里，花鰻鱺魚皮膠原蛋白自組裝后出現(xiàn)的是網(wǎng)狀的交錯(cuò)條紋纖維結(jié)構(gòu)。這與Zhang等[25]報(bào)道的鱘魚皮膠原蛋白的膠原纖維SEM圖相似。張強(qiáng)等[17]在報(bào)道鰱魚皮ASC和PSC(pepsin soluble collagen)膠原蛋白的膠原纖維微觀結(jié)構(gòu)時(shí)，認(rèn)為酸法保持了膠原纖維原有的結(jié)構(gòu)，而胃蛋白酶法對膠原纖維的結(jié)構(gòu)有一定的影響。我們在研究中也有嘗試用酸法和酶法分別提取，但提取得率都不及胃蛋白酶結(jié)合酸法的，從圖7可以發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶結(jié)合酸法提取得到的花鰻鱺魚皮膠原蛋白所形成的凝膠很好地保持了膠原纖維原有的結(jié)構(gòu)。通常，酶溶性膠原不具備成纖維能力，因?yàn)槎穗谋晃傅鞍酌盖械艉螅蝗菀仔纬衫w維凝膠，但這里形成的凝膠纖維直徑卻較大，值得討論。分析可能的原因有：一是花鰻鱺的魚皮比一般魚皮要厚實(shí)得多；二是提取時(shí)所用的酶量小，主要還是靠乙酸破壞膠原氫鍵促使膠原蛋白溶解到溶液中。

4 結(jié)論

SDS-PAGE結(jié)果表明花鰻鱺魚皮膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，氨基酸組成中Gly約占1/3，Gly∶Pro∶Hyp三者的比值約為8∶3∶2；膠原蛋白分子中存在共軛體系，最大的紫外吸收峰出現(xiàn)在波長222.6 nm處，紅外光譜吸收峰中有酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等膠原蛋白的特征吸收峰，熱變性溫度為28 ℃。紅外光譜圖和SEM掃描結(jié)果均顯示經(jīng)胃蛋白酶處理酸溶得到的膠原蛋白保持了膠原原有的結(jié)構(gòu)。花鰻鱺魚皮膠原蛋白體外自組裝動(dòng)力學(xué)曲線圖表現(xiàn)為典型的三階段模式圖，即為包含遲滯期、成長期和穩(wěn)定期的曲線圖。