曾偉偉，王英英，尹紀(jì)元，湯亞方，李瑩瑩，王 慶，高彩霞，2，任 燕，劉 春，石存斌

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津，300384)

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)是我國(guó)最主要的淡水魚(yú)養(yǎng)殖品種[1]，其產(chǎn)量約占整個(gè)淡水魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的20%。然而，由草魚(yú)呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)引起的草魚(yú)出血病的頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重制約了草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。GCRV主要危害當(dāng)年的草魚(yú)魚(yú)苗，死亡率一般為 30%～50%，最高可達(dá) 60%～100%[3-4]，GCRV具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60～70 nm，二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，基因組由11條分節(jié)段的雙鏈RNA組成[5]。目前己報(bào)道有30多個(gè)分離株，包括854、861、873、991、 HZ08、JX09-01、 JX09-02、 GD108、109、HGDRV株等[6-11]，通過(guò)現(xiàn)有的分離株基因組序列信息，我國(guó)的GCRV分離株可分為3個(gè)基因型[4,6-7，12]。當(dāng)前，全國(guó)各地分離到的流行株中，三類(lèi)亞型均有報(bào)道，有單獨(dú)感染，也有混合感染，目前導(dǎo)致草魚(yú)出血病流行和暴發(fā)主要是以HZ08為代表株的GCRV-Ⅱ型為主，占了90%以上[6,13]，因此，近年來(lái)無(wú)論是基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究，主要聚焦于GCRV-Ⅱ[6,14-15 ]。

GCRV-Ⅱ接種常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞均不能產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，但對(duì)魚(yú)體的致病力則比較強(qiáng)[16]。由于GCRV-Ⅱ感染細(xì)胞沒(méi)有CPE現(xiàn)象，使得對(duì)于該病毒的分離、鑒定及病毒含量的測(cè)定等都帶來(lái)了一定的不便。無(wú)論是關(guān)于GCRV-Ⅱ的病原學(xué)及致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究，還是抗病毒藥物及疫苗等防控產(chǎn)品研制，都涉及到如何測(cè)定該病毒的含量和病毒滴度問(wèn)題。近幾年來(lái)，研究人員建立了多種測(cè)定GCRV-Ⅱ病毒含量的方法，劉寶芹等[17]根據(jù)GCRV HZ08 株S7 基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)能特異性擴(kuò)增引物和TaqMan 探針，建立了HZ08 株熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)方法，用于HZ08株這一類(lèi)型病毒的快速檢測(cè)和定量分析。之后，黃綺雯等[18]對(duì)這一方法進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)所有已知GCRV-Ⅱ分離株的S2基因保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)引物和TaqMan 探針，建立了GCRV-Ⅱ病毒qPCR方法，可用于當(dāng)前所有GCRV-Ⅱ分離株的快速檢測(cè)和定量分析。曾偉偉等[19]以接種GCRV-Ⅱ病毒的細(xì)胞培養(yǎng)板為抗原板，以免疫弱毒疫苗的草魚(yú)血清為抗體，通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了檢測(cè)GCRV-Ⅱ病毒及其血清抗體的免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)方法，該方法可用于GCRV-Ⅱ型的流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)及抗原抗體檢測(cè)，結(jié)合計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)的方法，亦可用于GCRV-Ⅱ病毒滴度的測(cè)定。Wang等[20]利用抗GCRV-Ⅱ病毒S10基因編碼蛋白抗體建立了間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect fluorescent assay，IFA)，可用于檢測(cè)GCRV Ⅱ在細(xì)胞內(nèi)增殖情況和病毒滴度。qPCR、IPMA和IFA三種方法均可以用于GCRV-Ⅱ的含量測(cè)定，但目前還未有系統(tǒng)的比較過(guò)這三種方法的優(yōu)劣，在何種情況下需要用哪一種或哪幾種方法更加合適和可靠。本研究系統(tǒng)比較qPCR、IPMA和IFA三種方法檢測(cè)和定量分析GCRV-Ⅱ的特異性、敏感性、可靠性及檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，為后續(xù)GCRV-Ⅱ的基礎(chǔ)研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中病毒含量測(cè)定方法的選擇提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Medium199(M199)培養(yǎng)基、0.25%-EDTA胰蛋白酶和胎牛血清(FBA)均為GIBCO公司產(chǎn)品；Premix Ex Taq(Probe qPCR)，PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)均為大連寶生物公司產(chǎn)品；E.Z.N.A.Total RNA Kit為OMEGA公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗(HRP-IgG)和 3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)為Sigma 公司產(chǎn)品； 其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。ABI QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀為美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)公司ABI產(chǎn)品； PICO 17型離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；數(shù)碼倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-S)為日本尼康公司產(chǎn)品。

1.2 毒株、細(xì)胞和抗體

GCRV I型GZ1208株、GCRV Ⅱ型Huan1307及HZ08株、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、大口黑鱸虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，LMBV)、錦鯉皰疹病毒(koi herpers virus，KHV)均由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，GCRV Ⅲ型HGDRV株由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員惠贈(zèng)。草魚(yú)吻端成纖維細(xì)胞(proboscis snout into fibers，PSF)由本實(shí)驗(yàn)室建立并保存，用于GCRV病毒的增殖。鯉魚(yú)腦細(xì)胞系(common carp brain ，CCB)由德國(guó) KHVD 參考實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，用于SVCV、LMBV和KHV的增殖。兔抗GCRV-Ⅱ陽(yáng)性血清和陰性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.3 qPCR方法

qPCR 檢測(cè)方法參照黃綺雯等[18]建立的方法，略有修改，簡(jiǎn)要步驟如下：參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒核酸提取和反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；qPCR擴(kuò)增引物和探針?lè)謩e為：上游引物 F：5′-CCGGATACTCACCA-3′，下游引物R：5′-CGCTGATGTAATTGATGCC-3′，擴(kuò)增片段大小為156 bp；TaqMan探針序列：5′FAM-GGA TCA TTT ACG TCG TAT T-TAMRA3′，長(zhǎng)19 bp；qPCR反應(yīng)體系為Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)12.5 μL，PCR 上下游引物各0.5 μL(終濃度均為 0.25 μmol/L)，TaqMan探針1.0 μL(終濃度為0.25 μmol/L)，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.25 μL，DNA或cDNA 模板2 μL，加ddH2O 至總體積為25 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s； 擴(kuò)增反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，變性 95 ℃ 5 s，60 ℃ 退火/延伸 35 s。

1.4 IPMA方法

IPMA主要方法參照曾偉偉等[19]建立的方法，略有修改，簡(jiǎn)要步驟如下：將病毒感染PSF細(xì)胞或CCB細(xì)胞，感染5 d后先后用-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定，0.5% triton X-100的PBS(pH7.4)透化處理，5%脫脂奶粉的PBS 37 ℃封閉作用1 h或者4 ℃封閉過(guò)夜，然后加入兔抗GCRV Ⅱ 陽(yáng)性血清和陰性血清，37 ℃ 濕盒孵育1 h，PBS洗3次；加入稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗(HRP-IgG)，37 ℃ 濕盒孵育1 h，PBS洗3次，加入底物ACE，室溫顯色 15 min，3%雙氧水封閉，在倒置顯微鏡(Nikon，Eclipse Ti-S)下觀察并拍照。

1.5 IFA方法

IFA主要方法參照Wang等[20]建立的方法，略有修改，簡(jiǎn)要步驟如下：將PSF細(xì)胞或CCB傳代至共聚焦專(zhuān)用細(xì)胞培養(yǎng)板中，將病毒稀釋至1.0× 103拷貝/μL后接種細(xì)胞。感染5 d后取出用-20 ℃預(yù)冷的甲醇固定，再用0.5% triton X-100的PBS透化處理；然后用5%脫脂奶粉的PBS 37 ℃封閉作用1 h或者4 ℃封閉過(guò)夜；將兔抗GCRV-Ⅱ陽(yáng)性血清和陰性血清用PBS 進(jìn)行1∶200倍稀釋?zhuān)尤敫骺乖缀图?xì)胞對(duì)照孔，每孔50 μL，37 ℃ 濕盒孵育1 h，PBS洗3次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗，每孔300 μL，37 ℃ 濕盒孵育1 h，PBS洗3次；加入用PBS稀釋至終濃度為5 μg/mL 的PI，室溫作用10 min，進(jìn)行細(xì)胞核染色處理；以50% 甘油-PBS封片鏡檢，在聚焦熒光顯微鏡下(Nikon，ECLIPSE 80i)觀察結(jié)果并拍照。

1.6 三種檢測(cè)方法分析靈敏度比較

將GCRV-Ⅱ HuNan1307分離株接種PSF細(xì)胞7 d后收集的細(xì)胞病毒液用qPCR[20]的方法測(cè)定其初始濃度約為8.6× 105拷貝/μL，將該細(xì)胞病毒液用滅菌的PBS(pH7.4)10倍梯度稀釋至10-6次方，使病毒液濃度為8.6× 105～8.6× 10-1拷貝/μL 7個(gè)濃度梯度。分別用qPCR、IPMA和IFA三種方法對(duì)各濃度梯度的HuNan1307病毒液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度作3個(gè)重復(fù)，均取100 μL。其中IPMA和IFA同時(shí)結(jié)合TCID50法，通過(guò) Reed and Muench計(jì)算方法[21]來(lái)測(cè)定病毒的滴度，比較三種方法檢測(cè)GCRV Ⅱ的靈敏度差異。

1.7 三種檢測(cè)方法分析特異性比較

將GCRV GZ1208(GCRV-I)、HuNan1307(GCRV-Ⅱ)、HZ08(GCRV-Ⅱ)和HGDRV(GCRV-Ⅲ)株病毒均稀釋到1×103拷貝/μL濃度后分別感染PSF細(xì)胞，SVCV、LBMV和KHV均稀釋到1×103拷貝/μL濃度后分別感染CCB細(xì)胞，感染5 d后分別用上述描述的GCRV-Ⅱ三種檢方法進(jìn)行檢測(cè)，比較三種方法的特異性，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)分別設(shè)定未感染病毒的空白細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.8 三種檢測(cè)方法的診斷特異性和敏感性比較

經(jīng)病毒分離和PCR檢測(cè)鑒定，30份疑似草魚(yú)出血病GCRV陽(yáng)性和30份GCRV陰性血清共60份臨床樣品，分別用qPCR、IPMA和IFA方法對(duì)這60份樣品進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)這三種方法的診斷敏感性及診斷特異性。

1.9 三種方法在GCRV-Ⅱ定量上的相關(guān)性分析

為了比較qPCR、IPMA和IFA三種方法在GCRV-Ⅱ定量上的相關(guān)性，將PSF細(xì)胞傳代至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層鋪滿85%左右時(shí)，將HZ08和HuNan1307兩株GCRV-Ⅱ分離株稀釋至1.0× 103拷貝/μL后接種至PSF細(xì)胞(具體步驟見(jiàn)1.4)。在感染后3、7和14 d 每組分別采集3個(gè)平行重復(fù)孔的細(xì)胞病毒液。分別取等量的病毒液采用qPCR、IPMA和IFA進(jìn)行定量分析，其中qPCR測(cè)定病毒基因組拷貝數(shù)，IPMA和IFA則結(jié)合TCID50試驗(yàn)來(lái)測(cè)定病毒的滴度。采樣SPSS 22.0對(duì)三種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，建立qPCR檢測(cè)的病毒拷貝數(shù)、IPMA和IFA檢測(cè)的病毒TCID50兩兩之間的線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測(cè)方法的靈敏性分析

qPCR、IPMA和IFA三種方法分別對(duì)7個(gè)濃度梯度的GCRV-Ⅱ型草魚(yú)呼腸孤病毒HuNan1307分離株的檢測(cè)結(jié)果顯示，qPCR、IPMA和IFA三種方法檢測(cè)的最低限分別為8.6拷貝/μL、86拷貝/μL和86拷貝/μL，qPCR的檢測(cè)靈敏度比IPMA和IFA高一個(gè)數(shù)量級(jí)(見(jiàn)表1)。

表1 三種檢測(cè)方法分析靈敏性比較結(jié)果Tab.1 The results of detection sensitivity comparison

注：其中P表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陽(yáng)性，N表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陰性。

2.2 三種檢測(cè)方法的特異性分析

分別用qPCR、IPMA和IFA三種方法檢測(cè)GCRV HuNan1307、HZ08、GZ1208、104、SVCV、LBMV、KHV、PSF細(xì)胞和CCB細(xì)胞。結(jié)果顯示，三種方法的特異性均較好，GCRV-Ⅱ型分離株GCRV HuNan1307和HZ08三種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，而其它病毒株和未感染病毒的對(duì)照細(xì)胞均為陰性(見(jiàn)表2)。

表2 三種方法分析特異性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The results of analysis specificity comparison

注：其中P表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陽(yáng)性，N表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陰性。

2.3 三種檢測(cè)方法的診斷特異性和敏感性

分別用qPCR、IPMA和IFA三種方法對(duì)30份為GCRV陽(yáng)性和30份為GCRV陰性共60份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，qPCR檢測(cè)為陽(yáng)性的29份，為陰性的31份，其中1份陽(yáng)性樣品被檢測(cè)為陰性，其診斷敏感性和特異性分別為96.7%(29/30)和100%(30/30)；IPMA檢測(cè)為陽(yáng)性的32份，為陰性的28份，其中2份陰性樣品被檢測(cè)為陽(yáng)性，其診斷敏感性和特異性分別為100%(30/30)和93.3%(28/30)；IFA檢測(cè)為陽(yáng)性的30份，為陰性的30份，其診斷敏感性和特異性分別為100%(30/30)和100%(30/30)。qPCR與IPMA方法相比，29份qPCR檢測(cè)為陽(yáng)性的IPMA檢測(cè)到28份陽(yáng)性，1份陰性，31份qPCR檢測(cè)為陰性的IPMA檢測(cè)到27份陰性，4份陽(yáng)性， IPMA方法對(duì)qPCR方法的診斷敏感性和特異性分別為96.6%(28/29)和87.1%(27/31)；qPCR與IFA方法相比，29份qPCR檢測(cè)為陽(yáng)性的IFA檢測(cè)到28份陽(yáng)性，1份陰性，31份qPCR檢測(cè)為陰性的IFA檢測(cè)到29份陰性，2份陽(yáng)性，IFA方法對(duì)qPCR方法的診斷敏感性和特異性分別為96.6%(28/29)和93.5%(29/31)；IPMA與IFA相比，32份IPMA檢測(cè)陽(yáng)性IFA檢測(cè)30份陽(yáng)性，2份陰性，28份IPMA檢測(cè)為陰性IFA檢測(cè)均為陰性，IFA對(duì)IMPA的診斷敏感性和特異性分別為93.8%(30/32)和100%(28/28)。

表3 三種檢測(cè)方法對(duì)60份已知臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.3 The results of 20 clinical specimens tested with qPCR，IPMA and IFA.

注：其中P表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陽(yáng)性，N表示檢測(cè)為GCRV-Ⅱ陰性。

2.4 三種檢測(cè)方法定量結(jié)果的相關(guān)性

將HZ08和HuNan1307兩株GCRV-Ⅱ分離株感染PSF細(xì)胞后，分別取感染后3、6、9、12和15 d的細(xì)胞毒液采用qPCR、IPMA和IFA進(jìn)行定量分析，其中qPCR測(cè)定病毒基因組拷貝數(shù)，IPMA和IFA則結(jié)合TCID50試驗(yàn)測(cè)定病毒的滴度，來(lái)比較三種方法對(duì)GCRV-Ⅱ病毒定量分析的相關(guān)性。三種方法測(cè)定HZ08株感染PSF細(xì)胞后3～15 d的病毒含量分別是：qPCR為2.6×104～9.6×105拷貝/mL，IPMA為8.3×103～7.8×104TCID50/mL，IFA為9.2×103～8.6×104TCID50/mL，也就是說(shuō)qPCR檢測(cè)的病毒拷貝數(shù)大約比IPMA和IFA的病毒滴度值分別大8～12倍和7～11倍，相差一個(gè)數(shù)量級(jí)左右，而IPMA和IFA之間的檢測(cè)結(jié)果則沒(méi)有顯著差異；三種方法測(cè)定HuNan1307株感染PSF細(xì)胞后3～15 d的病毒含量分別是：qPCR為6.8×105～1.7×107拷貝/mL，IPMA為5.3×104～7.7×105TCID50/mL，IFA為5.6×104～8.9×105TCID50/mL，也就是說(shuō)qPCR的檢測(cè)的病毒拷貝數(shù)大約比IPMA和IFA的病毒滴度值分別大13～24倍和12～22倍；而IPMA和IFA兩種方法的檢測(cè)結(jié)果則沒(méi)有顯著性差異。SPSS對(duì)三種方法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析表明，其擬合曲線分別為：Y(IPMA，TCID50/mL)=23.629X-536 174(qPCR，拷貝/mL)(R2=0.996)、Y(IFA，TCID50/mL)=20.318X-575 062(qPCR，拷貝/mL)(R2=0.995)和Y(IPMA，TCID50/mL)=1.161X-1 176(IFA，TCID50/mL)(R2=0.999)。由此可見(jiàn)，三種方法對(duì)于GCRV-Ⅱ病毒的定量檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性。

表4 三種檢測(cè)方法對(duì)GCRV-Ⅱ病毒定量的相關(guān)性分析Tab.4 Comparison of qPCR，IPMA and IFA for the quantitation of GCRV-Ⅱ.

3 討論

由于GCRV-Ⅱ毒株接種常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞都沒(méi)有CPE，這一特性給GCRV-Ⅱ病毒的分離、鑒定、病原學(xué)研究和疫苗等防控產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)造成了較大的困擾。獸醫(yī)上，常見(jiàn)無(wú)CPE產(chǎn)生的病毒有豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒等，科研人員針對(duì)這些病毒，建立了間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)、熒光定量PCR(qPCR)等多種病毒檢測(cè)和病毒含量測(cè)定的方法[21-23]，應(yīng)用病原學(xué)基礎(chǔ)研究和防控產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。針對(duì)GCRV-Ⅱ 病毒，科研人員也先后建立qPCR、IPMA、IFA等方法用于病毒的檢測(cè)和含量測(cè)定，每種方法都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足，本研究從靈敏度、特異性和相關(guān)性多方面詳細(xì)比較了三種GCRV-Ⅱ檢測(cè)方法的特點(diǎn)。

分析靈敏性測(cè)試結(jié)果表明，qPCR、IPMA和IFA三種方法檢測(cè)的最低限分別為8.6 、86和86拷貝/μL，qPCR的檢測(cè)靈敏度最高，比IPMA和IFA高一個(gè)數(shù)量級(jí)；三種方法檢測(cè)GCRV HuNan1307和HZ08 GCRV-Ⅱ型分離株均為陽(yáng)性，其它病毒株和未感染病毒的對(duì)照細(xì)胞均為陰性，表明這三種方法的分析特異性均較好。采用這三種方法對(duì)已知的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，qPCR、IPMA和IFA三種方法的診斷敏感性和特異性分別為96.7%和100%、100%和93.3%以及100%和100%。qPCR在診斷敏感性方面較差一點(diǎn)，也就是說(shuō)qPCR方法可能存在一定的漏檢概率，雖然前面通過(guò)對(duì)病毒純培養(yǎng)物進(jìn)行分析敏感度研究表明，qPCR的分析敏感度高于IPMA和IFA，但是檢測(cè)臨床組織樣品時(shí)，由于組織樣品成分更為復(fù)雜，qPCR方法需要先提取組織樣品的總RNA再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，病毒核酸有可能被降解而導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)到。與常規(guī)PCR相比，qPCR不僅能定性，更能直接定量，因只需在加樣時(shí)打開(kāi)一次蓋子，隨后完全是閉管操作，可以有效地防止擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染和假陽(yáng)性且整個(gè)過(guò)程只需1 h左右，該技術(shù)不僅加快了檢測(cè)速度也有效地提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，特別適用于在早期病毒含量較低時(shí)檢測(cè)和病原學(xué)研究過(guò)程中的定量分析。雖然IPMA在診斷特異性方面相對(duì)遜色一些，這可能與直接通過(guò)可見(jiàn)光肉眼觀察判定結(jié)果存在一定誤判有關(guān)， IPMA方法的底物顯示棕褐色有較好的識(shí)別度，同一樣品IPMA和IFA方法測(cè)定的TCID50結(jié)果也相近，加之IPMA操作無(wú)需昂貴的熒光顯微鏡，用于GCRV-Ⅱ定量分析比IFA更容易實(shí)現(xiàn)。IFA方法的診斷敏感度與IPMA一樣，但是診斷特異性稍?xún)?yōu)于IPMA方法，兩種方法整個(gè)反應(yīng)原理和步驟均相似，唯一不同的是最后的結(jié)果觀察階段，IFA是通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果，有助于特異性的提高。

從前面的結(jié)果分析可以看出，qPCR、IPMA和IFA三種方法對(duì)GCRV-Ⅱ病毒的檢測(cè)和定量分析結(jié)果存在一定的差異，但都保持了較好的一致性和相關(guān)性，qPCR方法測(cè)得的病毒拷貝數(shù)含量比IPMA和IFA測(cè)得的TCID50值都高出一個(gè)數(shù)量級(jí)左右。Wang等[20]比較了GCRV-Ⅱ 分離株HZ08和GCRV-I分離株JX0901 qPCR和IFA定量檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，也存在相似的規(guī)律，不同的是qPCR結(jié)果測(cè)得的病毒拷貝數(shù)結(jié)果比IFA測(cè)得的TCID50結(jié)果高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能跟不同的病毒分離株特異性有關(guān)系。如采用qPCR和IFA測(cè)定水中感染性人腺病毒和JC多瘤病毒的含量時(shí)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性[24]，但通過(guò)qPCR測(cè)定的Tulane病毒拷貝數(shù)與通過(guò)細(xì)胞方法測(cè)得的TCID50之間卻沒(méi)有這種明顯的相關(guān)性[25]。雖然Wang等[20]證明qPCR和IFA的結(jié)果之間存在相關(guān)性，但并沒(méi)有量化他們之間的關(guān)系。牛成明等[23]將IFA測(cè)得的豬瘟兔化弱毒TCID50與兔體感染量(RID)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和擬合，建立了兩者間的線性數(shù)量關(guān)系。本研究也參照這個(gè)方法，在三種方法檢測(cè)結(jié)果具有較好相關(guān)性的基礎(chǔ)上，分別對(duì)qPCR測(cè)得病毒拷貝數(shù)及IPMA和IFA測(cè)得的TCID50進(jìn)行回歸分析，建立了兩兩之間相互的線性數(shù)量關(guān)系。由于qPCR測(cè)得的只是病毒核酸的含量，并不能反映具有感染性病毒的真正含量，也就是說(shuō)qPCR無(wú)法直接測(cè)定病毒滴度。IPMA和IFA方法測(cè)得的TCID50，直接檢測(cè)的是具有感染性的病毒含量，但這兩種方法實(shí)施起來(lái)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)都相對(duì)較高，普通實(shí)驗(yàn)室無(wú)法實(shí)現(xiàn)。本研究建立了病毒拷貝數(shù)和TCID50的線性關(guān)系后，通過(guò)qPCR方法就可以測(cè)算GCRV-Ⅱ的病毒滴度，為該病毒的滴度測(cè)定提供了一種新的選擇，對(duì)于GCRV-Ⅱ的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究均有一定的意義。