雷 坤，謝業(yè)揚(yáng)，馬遠(yuǎn)雄，王邦杰，范道周，陸專靈，徐娣美，何有柯，韋友傳

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000； 2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530000)

魚類出血病又稱為細(xì)菌性敗血癥、爆發(fā)性出血病，主要病癥為魚體各器官組織充血、出血，可造成魚類全身性出血甚至死亡[1]。研究表明嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、寄生蟲等多種病原都可導(dǎo)致魚類發(fā)生出血病病害[2-8]。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)屬鯉形目鰍科花鰍亞科副泥鰍屬，廣泛分布于東亞地區(qū)，為小型淡水底棲魚類。因其味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富被譽(yù)為“水中人參”[9]，已成為稻田養(yǎng)殖的主要魚類。2018年7月廣西那坡縣念頭村稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍發(fā)生出血病病害，病魚表現(xiàn)為離群、行動(dòng)遲緩、精神不振、不攝食，軀干兩側(cè)、鰭基部皮膚出血、腫脹；解剖結(jié)果顯示腹腔內(nèi)積水，胃部?jī)?nèi)無食物，后腎、肝臟不同程度出血。病程持續(xù)3周，死亡率達(dá)70%，給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍出血病病害還未見報(bào)道。本研究應(yīng)用病原微生物分離技術(shù)、回歸感染實(shí)驗(yàn)、生理生化鑒定、16S rDNA克隆測(cè)序和生物信息學(xué)等方法分離鑒定大鱗副泥鰍出血病病原、分析病原的致病性、測(cè)定病原藥物敏感性，以期為防控稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍出血病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病大鱗副泥鰍體質(zhì)量(14.2±5.2)g，來自廣西百色市那坡縣某稻田養(yǎng)殖場(chǎng)。健康大鱗副泥鰍400條，體質(zhì)量(22.6±8.3)g由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬基地贈(zèng)送，實(shí)驗(yàn)室水族箱暫養(yǎng)兩周，水溫(26±2)℃，每天喂食1次商品顆粒飼料，確認(rèn)健康狀態(tài)良好后用于回歸感染實(shí)驗(yàn)。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；水解酪蛋白瓊脂(MH)和兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。藥敏紙片和細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自艾德萊生物科技有限公司。引物合成和16S rDNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 病原菌分離

無菌條件下，從患病大鱗副泥鰍病灶部位(體表、肝臟、后腎)取樣，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)16 h，挑選單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落再次劃線培養(yǎng)，兩次純化后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接到斜面普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基保種備用。

1.3 回歸感染實(shí)驗(yàn)

取斜面瓊脂培養(yǎng)基中的保種菌株接種于普通LB液體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫震蕩過夜，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度。用PBS制備濃度為5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011CFU/mL菌懸液，PBS作為對(duì)照組。采用腹腔注射法，注射劑量為0.1 mL/條，每組20條。注射后飼養(yǎng)于水族箱，實(shí)驗(yàn)期間正常投喂，觀察兩周，每天記錄實(shí)驗(yàn)魚發(fā)病死亡情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS軟件計(jì)算半致死量LD50。

1.4 生理生化鑒定

取致病菌株分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與兔血瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌株形態(tài)特征及溶血性。革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。用細(xì)菌生化微量鑒定管對(duì)致病菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5 16S rDNA分子鑒定

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA。16S rDNA PCR擴(kuò)增所需通用引物分別為：上游引物F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物R1：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.15%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收純化，PCR回收產(chǎn)物連接至pTOPO-T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TOP10，挑選陽(yáng)性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.6 序列比對(duì)以及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用SeqMan軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果拼接。使用在線軟件BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行同源基因的搜索、DNAstar軟件進(jìn)行同源性分析、MEGA5.0軟件以及鄰接法構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(設(shè)定bootstraps為1 000)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用K-B紙片擴(kuò)散法[10]。即以涂布法接種擴(kuò)大培養(yǎng)后的致病菌菌液(2×108CFU/mL)到MH固體培養(yǎng)基，然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h后測(cè)定抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸感染實(shí)驗(yàn)

從病灶部位體表、肝臟和后腎組織分別分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為DLFNQ-1、DLFNQ-2、DLFNQ-3。人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLFNQ-2、DLFNQ-3各梯度菌液對(duì)大鱗副泥鰍不具致病性；DLFNQ-1對(duì)大鱗副泥鰍具有致病性。DLFNQ-1致死率為0%的最大菌懸液濃度為5×104CFU/mL，致死率為100%的最小菌懸液濃度為5×1010CFU/mL；其中5×105、5×106、5×107、5×108、5×109CFU/mL 菌懸液組2周內(nèi)死亡數(shù)分別為4、7、11、14、17只。使用SPSS軟件中的分析-回歸-Probit功能計(jì)算DLFNQ-1的LD50為2.3×107CFU/mL。

回歸感染注射DLFNQ-1菌懸液后部分試驗(yàn)魚體表粘液消失，繼而腫脹出血，解剖結(jié)果顯示腹腔內(nèi)少量積水，肝臟與后腎出血，與自然發(fā)病的大鱗副泥鰍癥狀一致；對(duì)感染魚進(jìn)行細(xì)菌再分離得到菌落形態(tài)單一的菌落，生化鑒定結(jié)果與DLFNQ-1一致。PBS對(duì)照組大鱗副泥鰍未出現(xiàn)死亡情況，也無任何病癥出現(xiàn)，活力與正常個(gè)體無差別。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

DLFNQ-1在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)狀況良好，菌落表面光滑、圓整、微微凸起、無色或淡黃色，菌落半透明且具有芳香氣味，直徑1.5～2 mm，革蘭氏染色結(jié)果顯示其為陰性短桿狀，兩端鈍圓(圖1)。在兔血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成β溶血環(huán)。DLFNQ-1的葡萄糖、阿拉伯糖、氧化酶、七葉靈反應(yīng)均為陽(yáng)性；檸檬酸、尿素酶、MR等反應(yīng)均為陰性(表1)初步鑒定DLFNQ-1菌株為嗜水氣單胞菌。對(duì)感染魚進(jìn)行致病菌再分離得到一優(yōu)勢(shì)菌株，其菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果以及生理生化特性與DLFNQ-1一致。

2.3 16SrDNA基因序列分析

以分離得到的DLFNQ-1菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示單一條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收連接轉(zhuǎn)化，挑選菌液陽(yáng)性克隆送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示DLFNQ-1菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 509 bp(圖2)，序列已提交GenBank(登錄號(hào)：MK142306)。在線工具進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示其與嗜水氣單胞菌(登錄號(hào)：JN391411.1)的相似度高達(dá)99.7%。

項(xiàng)目DLFNQ-1嗜水氣單胞菌葡萄糖++果糖++麥芽糖++纖維二糖--阿拉伯糖++蔗糖++甘露糖++半乳糖++伏普++吲哚++氧化酶++硝酸鉀++精氨酸雙水解++檸檬酸--賴氨酸脫羧酶++七葉靈++尿素酶--已二酸--甲基紅--

注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性

2.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

選擇GenBank中氣單胞菌科(Aeromonas)、弧菌科(Vibrionaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)共計(jì)12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA5軟件以鄰近法構(gòu)建(Bootstrap值為1 000)DLFNQ-1菌株16SrDNA基因的N-J進(jìn)化樹。結(jié)果顯示DLFNQ-1菌株16S rDNA序列與嗜水氣單胞菌聚為一支，具有較高的Bootstrap值(圖3)。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，確定DLFNQ-1為嗜水氣單胞菌。

圖2 DLFNQ-1的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA gene of the DLFNQ-1

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

病原菌DLFNQ-1對(duì)17種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。該菌株對(duì)慶大霉素、妥布霉高度敏感，對(duì)阿洛西林、哌拉西林、卡那霉素、新霉素、鏈霉素等中度敏感，對(duì)青霉素、左氟沙星、阿莫西林等呈現(xiàn)一定程度的耐藥性。

圖3 菌株DLFNQ-1的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from DLFNQ-1，and other related bacteria 發(fā)育樹上的Bootstrap值為1 000，菌株DLFNQ-1用(◆)表示。

表2 病原菌DLFNQ-1的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The drug sensitivity test of the DLFNQ-1

注：抑菌圈直徑包括藥敏片直徑，S：高度敏感，I：中度敏感，R：不敏感

3 討論

嗜水氣單胞菌隸屬氣單胞菌科氣單胞菌屬，在淡水、污水及土壤中廣泛分布?？筛腥径喾N動(dòng)物，如大鯢(Andrias)[11]、黃鱔(Monopterusalbus)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、胡子鯰(Clariasfuscus)[14]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[15]、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)[16]，在蚌科[17]、蟹類[18]中也有嗜水氣單胞菌引起病害的報(bào)道；其感染人類導(dǎo)致腹瀉發(fā)生[19]。本研究從稻田養(yǎng)殖的患出血病大鱗副泥鰍中分離獲得嗜水氣單胞菌，回歸感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì)健康大鱗副泥鰍具有致病性。這與前人報(bào)道的嗜水氣單胞菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有致病性相一致。但是引起泥鰍出血病的細(xì)菌存在多樣性：維氏氣單胞菌可導(dǎo)致泥鰍下頜腹部發(fā)紅，肝臟脾臟出血[5]；溫和氣單胞菌可導(dǎo)致泥鰍體表呈點(diǎn)狀出血，腹部腫脹[6]；豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)可導(dǎo)致泥鰍體表表皮剝落進(jìn)而在這些部位出現(xiàn)血斑，并且腸道有出血癥狀[20]。本次分離得到的嗜水氣單胞菌引起大鱗副泥鰍體表、鰭基部皮膚腫脹出血，后腎、肝臟不同程度出血，與上述氣單胞菌引起泥鰍出血病的病癥表現(xiàn)并不完全一致，可能是嗜水氣單胞菌與其它氣單胞菌不同的致病機(jī)制導(dǎo)致的，具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究分離得到的嗜水氣單胞菌半致死濃度為2.3×107CFU/mL，也有研究顯示嗜水氣單胞菌對(duì)健康加州鱸(Micropterussalmoides)的半數(shù)致死劑量為5.7×105CFU/mL[2]；嗜水氣單胞菌濃度達(dá)到5×104CFU/mL 時(shí)黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)死亡率在40%～50%[21]；嗜水氣單胞菌對(duì)黃河鯉(Cyprinuscarpio)的半致死濃度為1.38×107CFU/mL[22]。表明不同的水生動(dòng)物對(duì)嗜水氣單胞菌具有不同的毒力耐受性。嗜水氣單胞菌為條件性致病菌，其致病性會(huì)因環(huán)境改變而有所不同，因此嗜水氣單胞菌對(duì)大鱗副泥鰍半致死濃度還可能與稻田養(yǎng)殖的環(huán)境有關(guān)。

目前抗生素類藥物仍然是治療水生動(dòng)物病害的主要手段。對(duì)DLFNQ-1菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李煥榮等[23]、楊寧等[24]和余波等[11]報(bào)道的嗜水氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果不完全一致。其原因可能是感染不同物種的嗜水氣單胞菌因感染對(duì)象和環(huán)境的不同而產(chǎn)生變異；也可能是不同物種的嗜水氣單胞菌對(duì)抗生素類藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[25-26]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)，稻田養(yǎng)殖大鱗副泥鰍出血病的防治建議使用對(duì)嗜水氣單胞菌高度敏感的慶大霉素或妥布霉素。此外，在稻田養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意減少不合理操作對(duì)魚體表的創(chuàng)傷、適當(dāng)投喂?fàn)I養(yǎng)全面的飼料以及合理的換水，增強(qiáng)大鱗副泥鰍免疫力，從而減少病害的發(fā)生。