丁淑荃，陳 范，馬 歡，謝云軼，毛穎睿，王光毅，金 慧，董昭然，張?jiān)讫?/p>

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

氨對(duì)水生動(dòng)物具有極強(qiáng)的毒性[1]，而一些氣呼吸型魚類，如泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[2]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[3-5]等，可耐受非常高的體內(nèi)或體外氨。其主要原因是這些氣呼吸型魚類具有一些特殊的氨耐受策略[1,6]。盡管如此高濃度的體內(nèi)或體外氨并不能對(duì)這些氣呼吸型魚類造成致死效果，但仍舊會(huì)引起強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)動(dòng)物處于某種不良條件下會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)，從而在表觀水平或生理水平上影響其完整性[7]。通常來(lái)說(shuō)，應(yīng)激會(huì)對(duì)魚類造成多種不良反應(yīng)，如降低生長(zhǎng)速度[8]、形態(tài)學(xué)變化[9]、降低免疫力[10]及改變生理生化指標(biāo)[11]等。相較于陸生動(dòng)物，魚類所面臨的應(yīng)激因子更為廣泛，包括物理(如運(yùn)輸、裝載及捕撈)[12-13]和環(huán)境(如擁擠、低氧、污染物、溫度、鹽度及營(yíng)養(yǎng)不良)[10,14-16]因子。生理學(xué)響應(yīng)是魚類中最常用的應(yīng)激評(píng)價(jià)指標(biāo)。其中，血漿皮質(zhì)醇、血糖及乳酸含量是最常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)[11-12,17]。

大鱗副泥鰍是東亞地區(qū)重要的特種養(yǎng)殖品種之一[18-19]，據(jù)中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒(2019)報(bào)道，我國(guó)2018年度泥鰍(包括泥鰍、大鱗副泥鰍和臺(tái)灣泥鰍)的養(yǎng)殖總產(chǎn)量為35.84萬(wàn)噸，總產(chǎn)值約為71.68億元[20]。自然條件下，其棲息于淺水區(qū)域且經(jīng)常面臨階段性的干旱環(huán)境。當(dāng)棲息地缺水時(shí)，大鱗副泥鰍會(huì)鉆入濕潤(rùn)的泥土中，以后腸作為輔助呼吸器官，直接呼吸空氣[21]。在這種條件下，大鱗副泥鰍首先需要解決的問(wèn)題應(yīng)該是體內(nèi)氨的累積。前期研究結(jié)果表明大鱗副泥鰍具有幾種獨(dú)特的氨耐受策略以應(yīng)對(duì)過(guò)高的體內(nèi)或體外氨累積[3,5]。然而，大鱗副泥鰍對(duì)高濃度環(huán)境或體內(nèi)氨的應(yīng)激相應(yīng)仍不清楚。因此，本研究旨在闡明大鱗副泥鰍對(duì)高濃度環(huán)境和體內(nèi)氨的生理相響應(yīng)，為大鱗副泥鰍適應(yīng)體內(nèi)外氨累積的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用大鱗副泥鰍(25±4)g由合肥市周邊的水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)獲得。試驗(yàn)魚運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后暫養(yǎng)于60 L的水族箱中(盛水50 L)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)期間室溫24～26 ℃。暫養(yǎng)期間內(nèi)，每天換水，換水量為30%左右，養(yǎng)殖用水在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)曝氣96 h，水溫與室溫相同，水族箱每天連續(xù)充氣，每天投喂兩次商品飼料(粗蛋白35%，粗脂肪7%)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前24 h停止投餌。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空氣暴露組、氨暴露組和對(duì)照組3個(gè)組。將大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中進(jìn)行空氣暴露，盆中裝有很薄的一層蒸餾水(100 mL)以保持大鱗副泥鰍體表濕潤(rùn)，盆中的蒸餾水每隔8 h徹底更換一次以保證盆中的濕度。將大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中裝有10 L 30 mmo/L的NH4Cl溶液(以4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.2)，以此進(jìn)行氨暴露，盆中的NH4Cl溶液每隔24 h徹底更換一次以避免氨揮發(fā)造成的氨濃度降低。將4尾大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中裝有10 L 曝氣后的蒸餾水，以此作為對(duì)照組，盆中蒸餾水每隔24 h徹底更換一次。3個(gè)組的暴露時(shí)間均設(shè)置為0、12、24、 48、72及96 h，每個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置三個(gè)平行組，每個(gè)平行放置4尾魚。實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度為(24±1)℃，所有試驗(yàn)用水均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)靜置96 h以上，以保證水溫與室溫一致。

1.3 樣品采集及處理

每個(gè)暴露時(shí)間點(diǎn)結(jié)束，該時(shí)間點(diǎn)三個(gè)平行中的所有試驗(yàn)魚均以MS-222徹底麻醉。隨后以1 mL注射器從尾靜脈取血，置于肝素鈉潤(rùn)洗過(guò)的抗凝管中。取血后，在離心力4 000g、溫度4 ℃的條件下離心30 min，取上清液制備血漿。每個(gè)平行中的血漿由4尾試驗(yàn)魚合并而來(lái)。所有樣品均保存于-80 ℃的冰箱中待測(cè)。

1.4 生理指標(biāo)檢測(cè)

血漿皮質(zhì)醇含量以酶聯(lián)免疫法通過(guò)商業(yè)試劑盒測(cè)定(no.H094,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)，反應(yīng)溫度為37 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，以酶標(biāo)儀(華東電子DG5033A)檢測(cè)，單位為mmol/L。血糖和血漿乳酸含量通過(guò)商業(yè)試劑盒(no.F006 and A019-2,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)測(cè)定，反應(yīng)溫度均為37 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為505 nm和530 nm，以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，單位均為mmol/L。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析以SPSS 18.0 (SPSS Inc.Chicago,IL,USA)進(jìn)行。先以Levene’s檢驗(yàn)進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)檢測(cè)結(jié)果的顯著性水平，如果顯著則進(jìn)行Duncan’s多重比較。以t-檢驗(yàn)分析同一時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的顯著性。顯著性水平為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿皮質(zhì)醇水平

不同時(shí)間氨和空氣暴露后，大鱗副泥鰍血漿中皮質(zhì)醇含量的變化如圖1所示。氨和空氣暴露顯著影響大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇含量。氨暴露大鱗副泥鰍24 h內(nèi)，其血漿皮質(zhì)醇含量顯著增加，隨后則顯著下降，氨暴露72～96 h后血漿皮質(zhì)醇含量保持基本穩(wěn)定。12～96 h的空氣暴露后，空氣暴露組中血漿皮質(zhì)醇含量均顯著高于對(duì)照組。相似地，氨暴露大鱗副泥鰍12 h內(nèi)，其血漿皮質(zhì)醇含量也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，隨后則顯著下降，至72 h后則降至對(duì)照組水平。氨暴露12、24和48 h后，氨暴露組中血漿皮質(zhì)醇含量顯著高于對(duì)照組。

圖1 空氣和氨暴露對(duì)大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇含量的影響Fig.1 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected cortisol in the plasma of P.dabryanus

不同大寫字母表示不同時(shí)間空氣暴露之間差異顯著，不同小寫字母表示不同時(shí)間氨暴露之間差異顯著，不同阿拉伯?dāng)?shù)字表示對(duì)照組之間差異顯著，*表示空氣或氨暴露組與對(duì)照組之間差異顯著。下同。

2.2 血糖含量

圖2所示為氨和空氣暴露對(duì)大鱗副泥鰍血糖含量的影響。空氣暴露大鱗副泥鰍12 h內(nèi)并沒(méi)有顯著影響其血糖含量。而空氣暴露12 h后，大鱗副泥鰍血糖含量顯著增加，直至試驗(yàn)結(jié)束。而且，在空氣暴露24 h后，空氣暴露組血糖水平均顯著高于對(duì)照組。而氨暴露大鱗副泥鰍12 h內(nèi)，其血糖含量顯著增加。氨暴露12～72 h內(nèi)，其血糖含量呈緩慢增加的趨勢(shì)。而氨暴露大鱗副泥鰍72 h后，其血糖含量顯著增加，直至試驗(yàn)結(jié)束。氨暴露大鱗副泥鰍12～96 h后，氨暴露組中血糖含量均顯著高于對(duì)照組。

圖2 空氣和氨暴露對(duì)大鱗副泥鰍血糖含量的影響Fig.2 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected glucose in the plasma of P.dabryanus

2.3 血漿乳酸含量

從圖3中可看出，空氣暴露大鱗副泥鰍48 h內(nèi)，其血漿乳酸含量的變化并不顯著，但隨后顯著增加至穩(wěn)定水平，直至試驗(yàn)結(jié)束?？諝獗┞洞篦[副泥鰍72 h和96 h后，空氣暴露組血漿乳酸含量顯著高于對(duì)照組。而氨暴露大鱗副泥鰍則導(dǎo)致其血漿乳酸含量顯著上升，并在暴露12 h后到達(dá)峰值。隨后，血漿乳酸含量則顯著降低并在暴露96 h接近對(duì)照組水平。氨暴露大鱗副泥鰍12～72 h，氨暴露組中血漿乳酸含量顯著高于對(duì)照組。

圖3 空氣和氨暴露對(duì)大鱗副泥鰍血漿乳酸含量的影響Fig.3 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected lactate in the plasma of P.dabryanus

3 討論

在應(yīng)激狀態(tài)下，血漿皮質(zhì)醇和血糖含量是最常用的應(yīng)激評(píng)價(jià)指標(biāo)[11,22]。本研究中，氨和空氣暴露顯著影響大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇和血糖含量，而前期大量的研究結(jié)果也得出了類似的結(jié)論。在魚類中，神經(jīng)系統(tǒng)感受到外界環(huán)境的變化會(huì)迅速刺激腎上腺素的分泌，隨后會(huì)通過(guò)下丘腦-垂體-腎間細(xì)胞系統(tǒng)分泌皮質(zhì)醇，從而導(dǎo)致血漿皮質(zhì)醇含量上升[12,22-23]。應(yīng)激導(dǎo)致的血漿皮質(zhì)醇上升是非常迅速[24]的并且在應(yīng)激過(guò)程中能持續(xù)保持較高水平。本研究中，大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇含量在空氣暴露24 h內(nèi)和在氨暴露12 h內(nèi)顯著增加(圖1)，說(shuō)明體內(nèi)和體外氨累積對(duì)大鱗副泥鰍造成明顯的應(yīng)激反應(yīng)。隨后，大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇含量則呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)(圖1)，這可能是因?yàn)榇篦[副泥鰍體內(nèi)的氨耐受策略開(kāi)始起作用，從而促進(jìn)體內(nèi)皮質(zhì)醇的清除。前期研究已證實(shí)大鱗副泥鰍具有幾種有效的氨耐受策略[3-5]，而在其他氣呼吸型魚類中的研究也證實(shí)了這一結(jié)論的可靠性[6]。動(dòng)物體內(nèi)皮質(zhì)醇的代謝主要在肝臟中進(jìn)行[25]，且受到多種環(huán)境因素的影響，如鹽度等[24]。盡管本研究中的應(yīng)激因子持續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束，但大鱗副泥鰍血漿皮質(zhì)醇含量仍在空氣或氨暴露一段時(shí)間后顯著降低，甚至在氨暴露72 h后達(dá)到對(duì)照水平。本研究結(jié)果表明，大鱗副泥鰍擁有的氨耐受策略可起到抗體內(nèi)或體外氨累積應(yīng)激的作用。

魚類血糖含量的上升也屬于應(yīng)激第一階段[23]。這會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體糖異生和糖酵解作用[22]，從而導(dǎo)致血糖含量上升，這一階段被稱為應(yīng)激第二階段[26]。本研究結(jié)果顯示氨和空氣暴露可引起大鱗副泥鰍血糖含量顯著上升(P<0.05，圖2)，類似的研究結(jié)果還可見(jiàn)于斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[11]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[16]、大西洋鮭(Salmosalar)[17]及草魚(Ctenopharyngodonidella)[27]等。這一現(xiàn)象在魚類中普遍存在，因?yàn)轸~類在應(yīng)激狀態(tài)下所需的能耗更多。而且，血漿皮質(zhì)醇含量的上升也被證實(shí)會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體血糖含量的上升[12]。然而，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[28]和塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[29]的研究中卻得到了相反的結(jié)果。因此，需要精準(zhǔn)檢測(cè)出魚類血漿基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平，以此來(lái)評(píng)估皮質(zhì)醇上升誘導(dǎo)的血糖上升。另一方面，魚類對(duì)葡萄糖利用的機(jī)制至今仍未被闡明[30]。所以，后續(xù)的研究應(yīng)側(cè)重于魚類基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平的精準(zhǔn)檢測(cè)及魚類對(duì)葡萄糖的利用機(jī)理。

乳酸是魚類肌肉無(wú)氧代謝的產(chǎn)物。前期研究結(jié)果表明，魚類在應(yīng)激狀態(tài)下肌肉中乳酸的生成量更大，隨后會(huì)導(dǎo)致血漿乳酸含量上升。相關(guān)研究可見(jiàn)長(zhǎng)吻裸頰鯛(Lethrinusminiatus)[31]、圓口銅魚(Coreiusguichenoti)[32]、點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[33]及與米氏葉吻銀鮫(Callorhinchusmilii)[34]等種類。空氣和氨分別暴露大鱗副泥鰍72 h后和12 h內(nèi)，其血漿乳酸含量顯著上升(P<0.05，圖3)。相似地，南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)暴露于氨氮中也會(huì)導(dǎo)致其血漿乳酸含量顯著升高，這說(shuō)明水生動(dòng)物在氨應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體進(jìn)行補(bǔ)償性無(wú)氧代謝[35]。血漿乳酸含量的上升意味著機(jī)體缺氧或劇烈的運(yùn)動(dòng)。本研究中，氨暴露大鱗副泥鰍12 h后，其血漿乳酸含量顯著降低，且在暴露96 h時(shí)接近對(duì)照水平(P<0.05，圖3B)。同時(shí)，其血漿皮質(zhì)醇含量也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)(圖1)，說(shuō)明大鱗副泥鰍體內(nèi)的氨耐受機(jī)制起到了很好的抗氨應(yīng)激作用。眾所周知，乳酸作為一種無(wú)氧代謝產(chǎn)物，其對(duì)機(jī)體是有害的[13]。然而，對(duì)斑馬魚(Daniorerio)的研究結(jié)果卻表明，在寒冷脅迫下，乳酸的后續(xù)利用可作為維持其腦細(xì)胞生理機(jī)能的重要能量源[36]。這也為魚類氨應(yīng)激提供了另一個(gè)可選的研究方向。

4 結(jié)論

綜上，氨和空氣暴露可提高血漿皮質(zhì)醇、血糖及乳酸含量誘導(dǎo)大鱗副泥鰍進(jìn)入應(yīng)激第一和第二階段。本研究表明大鱗副泥鰍的氨耐受策略可有效緩解體內(nèi)和體外氨累積對(duì)其造成的應(yīng)激反應(yīng)。后續(xù)研究應(yīng)該側(cè)重于魚類基礎(chǔ)皮質(zhì)醇水平的精準(zhǔn)測(cè)定以及葡萄糖和乳酸的后續(xù)利用。