劉華敏，漆彥斌，雷志斌

（廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院，廣東 佛山 528300）

CHO 細胞，即中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells），具有不死性，可以傳代培養(yǎng)上百代，是生物技術(shù)藥物研發(fā)重要的工程抗體和重組蛋白的表達系統(tǒng)［1］，也是工業(yè)大規(guī)模化生產(chǎn)中最常見的細胞株，被廣泛作為外源基因的宿主生產(chǎn)蛋白藥物［2］。其優(yōu)點在于，具有轉(zhuǎn)錄后準確的修飾功能，表達的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能方面最接近天然分子蛋白［3-4］；屬于成纖維細胞，細胞內(nèi)源蛋白表達低，表達產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，便于收集目標表達產(chǎn)物［5］。

傳統(tǒng)的CHO 細胞培養(yǎng)方式是在含有血清的培養(yǎng)基中貼壁生長，血清在給細胞提供生長增殖所需的激素、生長因子、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營養(yǎng)物質(zhì)的同時，由于其所含成分復(fù)雜［6］，且不同產(chǎn)地、批次之間存在著質(zhì)量差異，因而給動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝造成了諸多不利影響。又因細胞培養(yǎng)獲得產(chǎn)物的過程中，血清成為分離和純化的主要障礙，因此，無血清培養(yǎng)基已成為哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展方向［7］。

在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中，細胞懸浮培養(yǎng)明顯優(yōu)于單層培養(yǎng)，是哺乳動物細胞首選模式［8］。CHO 細胞可以在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，適合工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。目前國內(nèi)的CHO 細胞化學(xué)成分限定的無蛋白培養(yǎng)基主要依賴Invitrogen、Sigma、Hyclone、Longza等國外試劑公司。當前針對CHO 細胞無血清培養(yǎng)基的研究，主要方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基如DMEM/F12的基礎(chǔ)上，添加蛋白水解物，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長因子、維生素、脂類、微量元素等［3，9-10］，這些都在一定程度上含有動物來源的蛋白或植物蛋白水解物，給生物制藥帶來風險。隨著人們對生物制品安全性要求的提高，無血清培養(yǎng)基，甚至化學(xué)成分限定的無蛋白培養(yǎng)基已逐漸成為今后發(fā)展的必然趨勢。因此，開發(fā)CHO 細胞化學(xué)成分限定的無血清培養(yǎng)基具有重要意義。

本文以CHO-K1細胞為研究對象，首先對貼壁細胞進行了懸浮馴化，之后在相同實驗條件下，統(tǒng)計三種培養(yǎng)基中細胞的增長率和存活率，比較了自配無血清培養(yǎng)基、Sigma Ex-CELL CD CHO 培養(yǎng)基和Gibco CD CHO 培養(yǎng)基馴化懸浮細胞CHO-K1-S 的培養(yǎng)效果，開發(fā)出適合CHO 細胞生長的低成本化學(xué)成分限定的無血清培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

1）細胞株。中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1）購自ATCC。

2）培養(yǎng)基。Ex-CELL CD CHO 購自美國Sigma公司；CD-CHO 購自美國 Gibco 公司；DMEM、F12和RPMI1640購自美國Corning 公司。

3）試劑。ITS 購自美國Sigma 公司；PBS 購自美國Corning 公司；FBS 購自美國 Gibco 公司。

1.2 方法

1）培養(yǎng)基的配置。將DMEM、F12和RPMI1640按照2∶1∶1的比例進行混合，混勻后，以此為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加ITS 配置成無血清培養(yǎng)基，將自配無血清培養(yǎng)基命名為CHO-SFM。

2）細胞的懸浮馴化。取對數(shù)生長期的CHO-K1貼壁細胞，采用逐步降血清法將含10% FBS 的F12培養(yǎng)基逐步替換為8%、5%、3%、2%、1%、0.5%FBS 的F12培養(yǎng)基進行適應(yīng)培養(yǎng)，每個血清濃度傳代培養(yǎng)15～20次，使細胞在各血清濃度培養(yǎng)基里適應(yīng)生長。

取適應(yīng)0.5% FBS 的F12低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的CHO-K1貼壁細胞，以5×105cells/mL 的密度接種到125 mL 的三角細胞搖瓶中，逐步加入含有50%、70%、80%、90%、100% Sigma Ex-CELL CD CHO 細胞培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2，100 rpm 條件下進行培養(yǎng)液的逐步替代培養(yǎng)。

3）懸浮細胞的培養(yǎng)。CHO-K1懸浮細胞的傳代培養(yǎng)：收集處于對數(shù)生長期的CHO-K1懸浮細胞，將細胞懸浮液收集到50 mL 無菌離心管中，800 rpm離心10 min，棄上清，加入新鮮的無血清培養(yǎng)基，輕輕吹散細胞團重懸細胞，以5×105cells/mL 的密度接種到125 mL 的三角細胞搖瓶中。將接種好細胞的搖瓶放入37 ℃，5% CO2，100 rpm 條件下的搖床培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

4）細胞密度和細胞存活率。分別用CHOSFM、Ex-CELL CD CHO 和CD-CHO 三種無血清培養(yǎng)基對正常傳代的CHO-K1懸浮細胞進行接種培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)7天，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，每24 h 進行一次細胞計數(shù)和存活率的統(tǒng)計。

用全自動細胞計數(shù)儀CountStar 檢測細胞密度。采用臺盼藍染色法計細胞活率，用血球計數(shù)板計數(shù)，測定細胞的存活率。以細胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標軸，以細胞密度和細胞活率為縱坐標軸繪制細胞生長和存活率曲線。

2 結(jié)果

2.1 貼壁細胞的低血清適應(yīng)培養(yǎng)

顯微鏡觀察適應(yīng)各血清濃度CHO-K1細胞的生長狀況，細胞形態(tài)較一致，呈不規(guī)則多邊形，緊密排列，細胞生長速度快，增殖能力強，為典型的上皮細胞系。當血清少于1%時，細胞形態(tài)由多邊形變成長梭形，但經(jīng)多次傳代適應(yīng)培養(yǎng)，最終趨于正常，如圖1所示。

圖1 CHO-K1細胞在FBS 濃度為0.5%培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)（×100）

2.2 三種培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)

CHO-K1細胞在馴化之前細胞貼壁生長，呈梭形。經(jīng)過Ex-CELL CD CHO 無血清培養(yǎng)基馴化后獲得的無血清懸浮型CHO-K1-S 細胞呈球形，分散性好，細胞透亮，存活率高，生長狀態(tài)好，如圖2所示，說明成功完成了貼壁細胞的懸浮馴化。

圖2 CHO-K1-S 懸浮細胞的生長狀態(tài)（×100）

每天觀察CHO-SFM、Ex-CELL CD CHO 和CDCHO 三種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-K1-S 懸浮細胞的生長狀況和形態(tài)。倒置顯微鏡下可看到細胞均呈圓形，大小一致，均勻分散在培養(yǎng)基中。證明三種無血清培養(yǎng)基都能夠滿足CHO-K1-S 懸浮細胞的生長需求。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，接種細胞第4天，細胞密度達到高峰，其中CHO-SFM 培養(yǎng)的細胞密度最高，達到6×106cells/mL。Ex-CELL CD CHO 和CD-CHO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞密度分別為5.5×106cells/mL和5×106cells/mL，見圖3。細胞培養(yǎng)前4 d 細胞培養(yǎng)基能夠基本滿足細胞營養(yǎng)需求，細胞活率均保持在95%以上，三種培養(yǎng)基差別不大。培養(yǎng)至5～7 d 細胞活率逐漸下降，可能是由于后期營養(yǎng)的消耗以及代謝廢物的積累導(dǎo)致，見圖4。綜合以上結(jié)果說明，CHO-K1-S 懸浮細胞在自配無血清培養(yǎng)基CHO-SFM中的生長情況優(yōu)于其它兩種進口培養(yǎng)基；Ex-CELL CD CHO 無血清略優(yōu)于CD-CHO 的無血清培養(yǎng)基。

圖3 三種無血清培養(yǎng)基中的細胞生長密度

圖4 三種無血清培養(yǎng)基中的細胞存活率

3 討論

CHO-K1貼壁細胞從有血清到低血清培養(yǎng)，在含1% FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的時候出現(xiàn)細胞呈拉長狀態(tài)，細胞生長減緩的現(xiàn)象，可能是因為低血清導(dǎo)致細胞代謝轉(zhuǎn)換的原因。經(jīng)多次傳代適應(yīng)低血清培養(yǎng)，細胞逐漸恢復(fù)至原來的狀態(tài)。表明在長時間逐步降血清適應(yīng)過程中，細胞通過調(diào)整代謝途徑，維持細胞活性［11］。在懸浮培養(yǎng)過程中，易出現(xiàn)細胞死亡和結(jié)團現(xiàn)象［12］，本實驗采用長期適應(yīng)馴化，通過傳代丟棄死亡和結(jié)團細胞的數(shù)量，逐步篩選出適合懸浮生長的細胞CHO-K1-S。

本研究中，在相同實驗條件下，Ex-CELL CDCHO 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞密度略多于CD-CHO的無血清培養(yǎng)基可能是因為懸浮馴化培養(yǎng)時選用了Ex-CELL CD-CHO，實驗過程中細胞在該培養(yǎng)基中不用經(jīng)歷換用培養(yǎng)基的適應(yīng)過程，更適合CHO-K1-S細胞的懸浮培養(yǎng)。但是自配無血清培養(yǎng)基CHO-SFM中的細胞密度始終高于Ex-CELL CD-CHO 無血清培養(yǎng)基，說明自配無血清培養(yǎng)基CHO-SFM 在克服了換用培養(yǎng)基的適應(yīng)過程中導(dǎo)致細胞生產(chǎn)遲滯的同時，給予懸浮細胞更充足的營養(yǎng)，更適合細胞的細胞增殖生長。

4 結(jié)論

本實驗采用長期適應(yīng)馴化將CHO-K1貼壁細胞成功馴化成懸浮細胞CHO-K1-S，該懸浮細胞呈圓形，大小一致，均勻分散在培養(yǎng)基中，細胞密度可達106cells/mL。自配無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)CHOK1-S 懸浮細胞時優(yōu)于兩種進口培養(yǎng)基；Ex-CELL CD CHO 無血清略優(yōu)于CD-CHO 的無血清培養(yǎng)基。開發(fā)出適合CHO-K1細胞生長的低成本無血清培養(yǎng)基。