伊佳虹，郭亞榮，王書敏，宋彬，仇海樂，賈軍梅

0 引言

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是發(fā)病率居全球第五的常見惡性腫瘤[1]。一旦確診，轉移率高、預后差[2]。HOX（homeobox）基因屬同源異型盒家族，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后關系十分密切[3]。研究發(fā)現(xiàn)該家族成員中的HOXB7可通過調控細胞增殖、血管生成等促進胃癌[4]、肺癌[5]、胰腺癌及乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[6-8]，且HOXB7可通過誘導上皮-間充質轉化（EMT）促進乳腺癌細胞的侵襲轉移[9]。TGF-β（transforming growth factor-β）作為一種生長因子，過度活化與多種疾病密切相關，如肝纖維化[10]、炎性反應[11]和腫瘤[12]等。Liu等[8]認為HOXB7與TGF-β可能通過活化TGF-β/SMAD3信號通路促進細胞侵襲進而導致乳腺癌進展。Komatsu等[13]報道HOXB7在肝細胞癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，其表達水平與肝細胞癌預后顯著相關，但HOXB7在HCC進程中的作用及機制尚未闡明。因此，本文采用HOXB7 shRNA轉染肝癌SMMC-7721細胞，探討HOXB7基因在肝癌細胞增殖、侵襲、遷移過程中的作用及部分機制，從而為尋找肝細胞癌的治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌SMMC-7721及HepG2細胞購自上海一研生物科技有限公司；RIPA、PMSF購自南京凱基；抗鼠二抗、抗兔二抗以及β-actin購自武漢三鷹生物技術有限公司；HOXB7、β-actin引物由山西賽奧科技有限公司合成；TGF-β購自杭州聯(lián)科公司；SMAD3購自英國Abcam公司；HOXB7 shRNA購自復能基因有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；Transwell小室、酶標板購自美國Corning公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所；轉染試劑Lipofectamine 2000購自中國賽默飛世爾公司；Anchored Oligo（dT）18試劑盒、ECL顯色液購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 將HepG2、SMMC-7721細胞培養(yǎng)于RPMI1640:FBS:PS=89:10:1的培養(yǎng)基中。分別對小干擾RNA組（實驗組）、陰性對照小干擾RNA組（陰性對照組）、空白對照組細胞使用1.2 μg DNA。按照轉染試劑Lipofectamine 2000說明手冊對HOXB7的mRNA進行轉染。

1.2.2 熒光定量PCR 按照說明書對肝癌SMMC-7721和HepG2細胞使用TransZol Up裂解液提取總RNA。通過Anchored Oligo(dT)18試劑盒得到反轉錄cDNA。利用2× TransStart? Tip Green qPCR SuperMix體系配置反應體系并放入熒光定量PCR儀，按照說明書進行PCR擴增。采用半定量分析計算HOXB7基因相關的mRNA表達水平。相關引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列Table1 Primer sequences amplified by PCR

1.2.3 Western blot檢測 用裂解混合液提取肝癌細胞或shRNA轉染后的細胞，使用BCA法測蛋白質濃度，于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進行電泳，并用不同抗體分別行免疫印跡分析，ECL顯色液避光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相。使用Image J軟件進行條帶灰度分析，其相對表達水平用目的蛋白條帶灰度與內參蛋白條帶灰度的比率表示。

1.2.4 CCK8實驗 將等量細胞接種于96孔板上培養(yǎng)24 h，根據細胞轉染步驟進行轉染，加入含有TGF-β抑制劑的新鮮無血清培養(yǎng)液再培養(yǎng)24 h。CCK8檢測細胞活性。用酶標儀在600 nm的參比波長下測定450 nm處的吸光度值。

1.2.5 劃痕實驗 按照Lipofectamine 2000的試劑說明書轉染細胞。24 h后，用200 μl尖端輕輕劃線，1×PBS沖洗兩遍，相差顯微鏡下分別取0、16、24 h三個時間點拍照，并計數劃痕處細胞數目。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 Transwell上層小室中加入Matrigel膠母液60 μl，培養(yǎng)箱孵育30 min后加入50 μl無血清RPMI1640培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，消化轉染HOXB7 shRNA（實驗組）、陰性對照shRNA（陰性對照組）及空白組細胞（空白對照組），各取200 μl接種于Transwell上層小室，加500 μl含10%胎牛血清或含抑制劑的無血清RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，吸取上層小室內基質膠、液體，PBS擦去膜上層細胞，4%多聚甲醛固定10 min。結晶紫染色后，在200×視野下觀察透膜細胞數。

1.3 統(tǒng)計學方法

利用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，結果以均數±標準差（）表示。t檢驗用于兩獨立樣本均值比較，單因素方差分析用于多樣本間均數比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HOXB7 mRNA基因在不同肝癌細胞系中的表達水平

熒光定量PCR 實驗結果顯示，肝癌SMMC-7721和HepG2細胞株中HOXB7 mRNA的表達量分別為（3.198±0.9291）和（1.053±0.376），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.021），見圖1。

2.2 shRNA敲除HOXB7基因表達的效果

空白對照組HOXB7 mRNA表達水平（1.038±0.395）與陰性對照組（0.943±0.006）差異無統(tǒng)計學意義（P=0.766），實驗組HOXB7 mRNA水平（0.450±0.670）較陰性對照組明顯降低（P=0.009），見圖2A；同時實驗組肝癌SMMC-7721細胞經HOXB7 shRNA轉染后HOXB7蛋白表達量較陰性對照組及空白對照組均降低（P=0.01），而陰性對照組與空白對照組HOXB7蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P=0.878），見圖2B。

圖1 Real-time PCR檢測肝癌細胞系中HOXB7 mRNA的表達量Figure1 HOXB7 mRNA expression in HCC cell lines detected by Real-time PCR

圖2 shRNA轉染SMMC-7721肝癌細胞的沉默效果Figure2 Silencing effect of shRNA on HOXB7 expression at mRNA(A) and protein(B) levels in SMMC-7721 cells detected by RT-PCR and Western blot

2.3 HOXB7基因敲減后對肝癌SMMC-7721細胞增殖能力的影響

CCK8 細胞活性實驗結果顯示，HOXB7 shRNA實驗組肝癌細胞的吸光度值（0.644±0.007）顯著低于空白對照組（1.068±0.006）與陰性對照組（1.096±0.052），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），而空白對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.889），見圖3。

圖3 CCK8法檢測shRNA轉染后SMMC-7721細胞的增殖能力Figure3 Proliferation of SMMC-7721 cells after shRNA transfection detected by CCK8 method

2.4 HOXB7基因敲減對肝癌SMMC-7721細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果顯示實驗組跨膜細胞數少于陰性對照組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），陰性對照組和空白對照組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.782），見圖4。

2.5 HOXB7基因敲減后對肝癌SMMC-7721細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示，與陰性對照組及空白對照組相比，24 h后實驗組肝癌細胞的遷移能力降低（P＜0.05），說明HOXB7低表達能抑制人肝癌SMMC-7721細胞的遷移能力，見圖5。

2.6 HOXB7基因敲除對肝癌SMMC-7721細胞TGF-β信號通路的影響

HOXB7基因敲除后，實驗組p-Smad3蛋白表達水平（0.624±0.232）較空白對照組（1.241±0.112）及陰性對照組（1.294±0.690）水平明顯降低（P＜0.001），空白對照組和陰性對照組p-Smad3蛋白表達量差異無顯著統(tǒng)計學意義（P=0.548），而實驗組Smad3蛋白表達水平與空白對照組及陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖4 Transwell檢測shRNA轉染后SMMC-7721細胞的侵襲能力 (×200)Figure4 Invasion ability of SMMC-7721 cells after shRNA transfection detected by Transwell assay (×200)

圖5 劃痕實驗檢測shRNA 轉染后SSMC-7721細胞遷移能力Figure5 Migration of SSMC-7721 cells after shRNA transfection measured by wound healing assay

圖6 Western blot法檢測HOXB7基因敲除對TGF-β信號通路的影響Figure6 Effects of HOXB7 gene knockout on expressions of TGF-β signal pathway detected by Western blot

3 討論

近年來原發(fā)性肝癌的發(fā)病率呈上升趨勢[14]，其中約90%的病理類型為肝細胞肝癌[15]，原發(fā)性肝癌主要治療方式為手術切除及局部治療，但大多數患者因確診時已為中晚期而失去手術治療機會[16]，目前晚期肝癌治療除了傳統(tǒng)的放化療以外，還可以采用分子靶向藥物治療以及免疫治療等方法[17]，然而大多數轉移性肝癌患者的生存現(xiàn)狀仍不理想。因此，闡明肝細胞肝癌發(fā)展的機制有助于改善肝細胞肝癌的預后。

同源盒基因 B7（HOXB7）為HOX基因家族中的一種轉錄調節(jié)因子，在DNA合成與轉錄方面有重要作用，其高表達可導致某些腫瘤的發(fā)生。研究表明HOXB7在多種腫瘤細胞內異常表達，且與腫瘤的預后密切相關[18-19]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中HOXB7基因表達顯著高于癌旁組織，這與Komatsu等[13]的研究一致，證實HOXB7作為癌基因參與了HCC的進程。為明確HOXB7對肝癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，本研究通過靶向HOXB7基因的shRNA轉染HOXB7表達量較高的肝癌SMMC-7721細胞株，Real-time PCR及Western blot的結果表明，實驗組中HOXB mRNA及蛋白表達水平受到明顯抑制，CCK8實驗結果表明實驗組細胞增殖能力較空白對照組和陰性對照組明顯下降，Transwell實驗結果表明實驗組跨膜細胞數較空白對照組和陰性對照組明顯減少，劃痕實驗結果提示實驗組肝癌SMMC-7721細胞的遷移能力較空白對照組和陰性對照組下降。本實驗說明肝癌SMMC-7721細胞的增殖與遷移能力隨著HOXB7表達下調而受到抑制，與課題組以往的研究結果一致，提示HOXB7可促進肝癌細胞的增殖活性、侵襲和遷移能力。

HOXB7在HCC進程中的作用機制目前尚無統(tǒng)一定論，據報道HOXB7可通過不同途徑發(fā)揮作用，包括上調c-Myc和Slug表達并激活AKT通路[9]、活化FGF介導的MAPK/ERK通路[20]等。此外，HOXB7還可以通過刺激FGF等生長因子的分泌從而介導上皮-間充質轉化（EMT）[21-22]發(fā)揮促癌作用，而TGF-β是參與EMT過程調節(jié)的主要因子之一[23]。TGF-β還可通過多種途徑促進腫瘤的侵襲、浸潤，如TGF-β可分別激活Smad和Non-Smad信號通路促進肝癌細胞EMT，從而促進腫瘤細胞的轉移[24]。其中信號轉導蛋白Smad3為TGF-β通路中重要的下游蛋白，該蛋白的異常表達可引起腫瘤的發(fā)生、進展與轉移[23]。其下游信號也可能是通過調控其他通路調節(jié)EMT、細胞遷移等過程促進肝癌的進展，如MEK/Erk、PI3K/Akt、MAPK等通路[25]。因此，為了進一步明確HOXB7促進HCC進程的作用機制，本研究利用Western blot實驗檢測HOXB7基因敲除后TGF-β通路中下游蛋白的活化水平，結果顯示實驗組Smad3蛋白表達水平較空白對照組及陰性對照組無明顯差異，而實驗組p-Smad3的表達較空白對照組及陰性對照組顯著下調。HOXB7敲除后Smad3的磷酸化水平下調，這提示HOXB7可能通過調節(jié)TGF-β通路中Smad3磷酸化促進肝癌細胞增殖、侵襲與遷移。然而HCC的侵襲、遷移是個復雜的過程，尤其是HOXB7在促進肝癌進展的具體分子機制尚未完全明確，后續(xù)還需開展關于TGF-β通路的一系列分子機制研究，進一步探討HOXB7在HCC進程中的分子機制。