王煒川，陳璐璐*，權(quán)香蘭,2，李穎，金永民，金文彪，于可心，張松男

0 引言

乳腺癌組織中存在少量乳腺癌干細胞，其具有干細胞特性，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展、耐藥及復發(fā)中起重要作用，并且由于乳腺癌干細胞大多數(shù)處于靜止狀態(tài)，僅有少部分進入細胞周期，從而導致對常規(guī)化療或放療療效不明顯。因此，如何有效地殺死這些乳腺癌干細胞是乳腺癌治療的挑戰(zhàn)[1]。

溶瘤腺病毒，能夠有效地轉(zhuǎn)染高增殖細胞（非干細胞）和靜止細胞（干細胞），與常規(guī)治療方法不同，溶瘤腺病毒的細胞毒性機制是物理裂解靶細胞，而不是通過ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette transporter,ABC）轉(zhuǎn)運蛋白使化療藥物泵出轉(zhuǎn)染細胞[2-4]。因此，它不受腫瘤干細胞化療或放射抗性機制的影響。盡管有許多研究報道了用溶瘤腺病毒治療乳腺癌，但關于乳腺癌干細胞的有效靶向策略卻很少[5]。

端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（TERT）是端粒酶的催化亞基，在正常細胞中幾乎不表達，但在惡性腫瘤細胞中高表達。已有研究表明人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）啟動子是癌癥基因治療的一個具有潛力的治療靶點[6-7]。端粒酶在癌細胞中起重要作用，含有端粒酶相關蛋白[8]、RNA亞基和催化亞基（hTERT），后者是端粒酶活性的主要決定因素[9]。生物信息學數(shù)據(jù)表明，hTERT是許多癌癥發(fā)展的易感基因[10-12]。因此，利用hTERT啟動子調(diào)節(jié)病毒關鍵基因的轉(zhuǎn)錄是通過溶瘤病毒選擇性靶向腫瘤細胞的潛在方式。

本實驗構(gòu)建人TERT啟動子驅(qū)動的重組溶瘤腺病毒（RCA-TERT-Ad35）治療TERT陽性乳腺癌細胞，旨在尋找治療乳腺癌的新型治療策略。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

MCF-7乳腺癌細胞系獲自中國科學院（中國上海）細胞庫，于10%胎牛血清及100 IU/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5%CO2（Thermo，美國）培養(yǎng)箱中孵育。

將MCF-7細胞以40 000個/毫升的密度懸浮于含有5 mg/ml胰島素、0.5 mg/ml氫化可的松、2% B27和20 ng/ml EGF的DMEM/F-12中，并接種于超低黏附6孔板（Corning，美國）。2周后傳代一次，通過離心收集乳腺球體，用胰酶（Sigma，美國）消化至單個MCF-7球體細胞（mammosphere cell,MS）用于后續(xù)實驗。

1.2 RT-PCR法檢測hTERT mRNA

根據(jù)Platinum Taq試劑盒（Invitrogen Corp，美國）的SuperScript一步法RT-PCR技術(shù)進行第一鏈cDNA合成和PCR反應。將反應混合物在50℃加熱30 min，然后進行30次循環(huán)PCR，包括94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸60 s和72℃保持2 min。針對PCR反應，設計正義和反義寡核苷酸引物（5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'；5'-GGATGAAGCGGAGTC TGGA-3'）。收集PCR產(chǎn)物（長度為150 bp），10%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 MTT測定法檢測細胞活力

將MCF-7和MS細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中。24 h后，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的紫杉醇（0、1、5、10、15、20 μmol/L）。培養(yǎng)72 h后，使用非放射性細胞增殖試劑盒通過MTT測定法測量細胞活力，并使用微量滴定板（ELISA）讀數(shù)器在490 nm處測量樣品的吸光度值（A）。細胞存活率計算公式：細胞存活率（%）=（轉(zhuǎn)染細胞的A值/未轉(zhuǎn)染對照細胞的A值）×100%。

1.4 腺病毒的構(gòu)建

將LacZ插入到腺病毒基因組E3基因座中建立非復制型的腺病毒RIA-LacZ。用35型腺病毒纖維基因替換原始的5型腺病毒纖維基因建立RIALacZ-Ad35和RCA-Ad35。用修飾的hTERT啟動子替換E1A啟動子構(gòu)建復制型腺病毒結(jié)構(gòu)圖，見圖1。所有病毒在原代人胚腎細胞293細胞中復制并通過CsCI密度純化而凈化，通過測量260 nm處的吸光度計算病毒顆粒數(shù)。

圖1標明的腺病毒載體均來源于全長5型腺病毒基因組。RIA-LacZ和RIA-LacZ-Ad35是復制缺陷型腺病毒，缺失整個E1區(qū)并表達插入E1區(qū)的報告基因LacZ。RCA-Ad35和RCA-TERT-Ad35是含有正常E1基因的復制型腺病毒，RCA-TERT-Ad35中的E1啟動子被修飾的hTERT啟動子取代。通過用35型腺病毒纖維基因替換原始的5型腺病毒纖維基因，建立RIA-LacZ-Ad35、RCA-Ad35和RCA-TERT-Ad35。

圖1 腺病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖Figure1 Structure schematic of adenovirus vectors

1.5 溶瘤腺病毒載體的轉(zhuǎn)導效力

將MCF-7和MS細胞以1×105個/孔的密度接種在24孔板中。RIA-LacZ、RIA-LacZ-Ad35分別以不同的感染復數(shù)（multiplicity of infection,MOI）梯度（0、0.2、1、5、20、100）轉(zhuǎn)染球形細胞。48 h后，用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色，以藍色滴度單位（btU）/ml表示。

1.6 溶瘤分析

將MCF-7細胞以3×104個/孔的密度接種于48孔板。培養(yǎng)24 h后，RCA-Ad35和RCA-TERT-Ad35分別以0.5、1、2、5和10的MOI梯度轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，37℃下孵育4天。各孔加入溶于PBS中的MTT溶液（5 mg/ml,20 μl）。徹底混合后微量板讀數(shù)器測量490 nm處的吸光度值評估細胞活力。

將MCF-7和MS細胞以5×104個/孔的密度接種于48孔板。24 h后，RCA-Ad35、RCA-TERT-Ad35或野生型腺病毒（WT-Ad）分別以不同的MOI梯度（0、0.5、1、2、5、10、20）轉(zhuǎn)染MCF-7或MS細胞。4天后，將細胞暴露于含有2%結(jié)晶紫染色液和20%的甲醇溶液中15 min，蒸餾水洗滌，攝影記錄溶瘤數(shù)。

1.7 動物實驗

在6～8周齡的雄性裸鼠（Charles River Japan Inc.，日本）中建立人異種移植腫瘤。小鼠腹部皮下植入1×107個MCF-7細胞。當異種移植腫瘤達到100 mm3（通過體積=0.523LW2計算）時，將小鼠隨機分成三組，每組6只。每隔一天向腫瘤內(nèi)注射5×1010VP的RCA-Ad35或RCA-TERT-Ad35或PBS 3次。每兩天測量腫瘤體積。

1.8 乳腺癌干細胞成瘤實驗

10%的胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞，通過傳代、擴增收集呈對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液，將裸鼠隨機分組6組，每組各5只。SPF環(huán)境下，每組裸鼠背部皮下分別接種5×104個/毫升、5×105個/毫升、5×106個/毫升MS和MCF-7細胞懸液。4周后比較腫瘤形成率。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用雙尾學生t檢驗（SPSS13.0軟件）進行統(tǒng)計分析，結(jié)果為平均值±標準誤差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用雙尾學生t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hTERT基因在MS細胞中過表達

非黏附條件下培養(yǎng)MCF-7細胞兩周后，細胞產(chǎn)生漂浮的球形菌落。與親代細胞相比，球形細胞中的hTERT基因表達增加，見圖2A，并且在整個球體傳代中穩(wěn)定維持。

2.2 球體細胞顯示出對常規(guī)抗腫瘤劑的顯著抗性

MTT試驗結(jié)果表明，乳腺癌MCF-7細胞通過懸浮培養(yǎng)獲得了干細胞樣特性。與其親代細胞相比，MS細胞對細胞毒性劑紫杉醇具有顯著耐藥性（P=0.023），見圖2B。

2.3 腺病毒的轉(zhuǎn)染效率

圖2 親本MCF-7細胞培養(yǎng)的微球體細胞(MS)具有高表達的TERT基因并且對化療耐藥Figure2 Mammosphere(MS) cells cultured from parental MCF-7 cells were with high expression of TERT gene and resistant to chemotherapy

β-半乳糖苷酶染色評估結(jié)果顯示，各組腺病毒的轉(zhuǎn)染效率與病毒濃度呈正相關，且與RIA-LacZ轉(zhuǎn)染的細胞相比，β-半乳糖苷酶在RIA-LacZ-Ad35轉(zhuǎn)染的細胞中顯著高表達，見圖3A。結(jié)果顯示：RIA-LacZ-Ad35轉(zhuǎn)染的MS細胞比RIA-LacZ-Ad35轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞具有更高轉(zhuǎn)染效率。

2.4 RCA-TERT-Ad35在MCF-7和MS細胞體外的溶瘤作用

在0.5、1、2 MOI梯度下，RCA-TERT-Ad35轉(zhuǎn)染的MCF-7或MS細胞相較于RCA-Ad35轉(zhuǎn)染顯示出更高的細胞毒性作用（P=0.038）；與親代MCF-7細胞相比，MS細胞對RCA-Ad35或RCATERT-Ad35更敏感（P=0.033）。在5和10 MOI劑量的病毒組中未見顯著差異，可能與細胞過量死亡有關，見圖3B。細胞病變效應（cytopathic effect,CPE）測定顯示RCA-TERT-Ad35比RCA-Ad35具有更高的細胞殺傷作用，并且MS細胞對病毒治療比MCF-7細胞更敏感，見圖3C。

2.5 RCA-TERT-Ad35在體內(nèi)的抗腫瘤功效

圖3 構(gòu)建的腺病毒載體在體外MCF-7/MS細胞中的轉(zhuǎn)染性和細胞毒性Figure3 Infectivity and cytotoxicity of constructed adenoviral vectors in MCF-7/MS cells in vitro

單獨使用PBS處理的小鼠顯示出侵襲性腫瘤生長，且第45天迅速達到2 200 mm3。然而，溶瘤腺病毒（RCA-Ad35或RCA-TERT-Ad35）處理的小鼠腫瘤生長受到顯著抑制。而且，RCA-TERTAd35治療組的療效優(yōu)于RCA-Ad35治療組。第45天，RCA-Ad35和RCA-TERT-Ad35處理的小鼠的平均腫瘤體積為810±220和341±124 mm3，與PBS處理組相比，腫瘤生長抑制率分別為63.2%和84.5%（P=0.025），見圖4。

2.6 MS和MCF-7細胞的腫瘤形成率

接種5×105/ml及5×104/ml細胞時，MS細胞的腫瘤形成率明顯高于MCF-7細胞，見表1。

3 討論

圖4 RCA-TERT-Ad35在MCF-7異種移植模型中的抗腫瘤作用Figure4 Anti-tumor effect of RCA-TERT-Ad35 in MCF-7 xenograft model

表1 MS和MCF-7細胞的腫瘤形成率比較Table1 Comparison of tumorigenesis rate between MS cells and MCF-7 cells

作為基因治療的載體，可塑性是腺病毒載體的重要特征。腺病毒本身不具有癌細胞特異性，有研究證實可通過修飾腺病毒載體來實現(xiàn)靶向特異性。例如，Zhang等[13]構(gòu)建了一種GP73調(diào)節(jié)的溶瘤腺病毒GD55，可以靶向肝癌干細胞樣細胞，并在裸鼠的異種移植中顯示出較強的腫瘤抑制能力。Ying等[14]構(gòu)建GOLPH2調(diào)控的溶瘤腺病毒以靶向前列腺癌干細胞，在體外和體內(nèi)對人前列腺癌實現(xiàn)顯著的抗癌作用。在另一項研究中，Mantwill等[15]使用溶瘤腺病毒以YB-1依賴性方式靶向腦膠質(zhì)瘤干細胞樣細胞。同時，Yang等[4]用TRAIL基因修飾溶瘤腺病毒可靶向肺癌干細胞樣細胞。Sato-Dahlman等[16]用CD133靶向基序取代了腺病毒載體纖維節(jié)中的主要CAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)了對CD133陽性結(jié)腸癌干細胞的特異性殺傷作用。

TERT發(fā)揮與干細胞維持和擴增相關但與端粒維持無關的功能[17-19]。本研究結(jié)果顯示通過懸浮培養(yǎng)獲得的MS細胞TERT高表達，表現(xiàn)出與先前報道一致的干細胞特征，我們評估了hTERT啟動子驅(qū)動溶瘤腺病毒RCA-TERT-Ad35復制以靶向具有陽性端粒酶活性的腫瘤細胞的可行性，結(jié)果表明可以通過靶向TERT選擇性地殺死癌癥干細胞。目前，已有許多研究使用TERT作為癌癥治療中腺病毒治療的靶標。如Ye等[20]構(gòu)建了由TERT啟動子驅(qū)動的溶瘤腺病毒載體，該載體特異性殺死了TERT陽性的癌細胞。在另一項研究中，TERT啟動子被用于驅(qū)動腺病毒載體中腫瘤抑制基因的表達，在卵巢癌細胞與正常成纖維細胞共培養(yǎng)模型中誘導腫瘤細胞特異性表達靶基因和凋亡[21]。Li等[22]將CCL20和CD40L基因插入腺病毒載體中，并構(gòu)建溶瘤腺病毒Ad-CCL20-CD40L,發(fā)現(xiàn)該新型溶瘤腺病毒抑制TERT陽性腫瘤細胞的生長并誘導細胞凋亡。Bauerschmitz等[23]已證實hTERT啟動子控制的溶瘤腺病毒在體內(nèi)外對胸腔積液中的CD44+/CD24-/low乳腺癌干細胞具有細胞毒性作用?；趆TERT-Ad構(gòu)建具有凋亡基因TRAIL的溶瘤腺病毒Ad/TRAIL-E1對放療耐藥的干細胞樣食管癌細胞的細胞毒性作用強于非端粒酶特異性溶瘤腺病毒[24]。

溶瘤腺病毒血清型5（Ad5）轉(zhuǎn)染宿主細胞是通過與柯薩奇-腺病毒受體（CAR）的纖維旋鈕相互作用啟動的。然而，CAR在許多癌細胞中低表達，這將影響5型腺病毒基因治療的轉(zhuǎn)導效率。與CAR不同，CD46在大多數(shù)腫瘤細胞中廣泛表達，其功能可能與補體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關[25-27]。35型腺病毒纖維對CD46具有高親和力，Yu等[28]報道的Ad5PTDf35是一種新的OncoAd，具有Tat-PTD修飾的六聚體和35種血清型纖維的Ad5載體，與未修飾的Ad5相比，顯著增強包括胰島和腫瘤起始細胞在內(nèi)的原代人細胞培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)導。同樣，本研究更換了具有35型纖維的5型腺病毒載體，顯著提高了腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。本研究結(jié)果顯示35型纖維似乎對干細胞樣癌細胞（MS細胞）比親代癌細胞（MCF細胞）具有更高的親和力，這表明MS細胞在獲得干細胞特性時也可能改變細胞表型，但未見類似報道，需要進一步的研究來證實。

綜上所述，本研究以TERT為靶標構(gòu)建纖維修飾腺病毒，治療乳腺癌干細胞樣細胞，RCATERT-Ad35比RCA-Ad35具有更高的細胞殺傷作用，并且MS細胞對病毒治療比MCF-7細胞更敏感，溶瘤腺病毒（RCA-Ad35或RCA-TERTAd35）處理的小鼠腫瘤生長受到顯著抑制。而且，RCA-TERT-Ad35治療組的療效優(yōu)于RCAAd35治療組，提示腺病毒載體有望成為腫瘤干細胞的一種有效治療手段。