JEONG YUNHO 趙志河

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）在口腔頜面部腫瘤中發(fā)病率中排首位，是頭頸部位置中惡性腫瘤中較為常見的疾病之一[1，2]。目前OSCC發(fā)病原理尚待探討，但已有文獻(xiàn)報(bào)道，遺傳易感性在OSCC 發(fā)展發(fā)揮主要作用[3，4]。既往文獻(xiàn)指出，單核苷酸多態(tài)性（single uncleotidepilymorphism，SNPs）是至關(guān)重要的遺傳因素；長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）中涵蓋200 多個(gè)核苷酸，是miRNA 樣特征新非編碼RNA 組家族中一員[5]。已驗(yàn)證IncRNA 中在母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene3，MEG3）基因編碼髓細(xì)胞在癌癥誘導(dǎo)過(guò)程、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面均有參與，MEG3 可調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的活化與增殖分裂，健康人機(jī)體組織中同樣含大量MEG3[6]。目前LncRNAMEG3 中SNPs 已大量報(bào)道與直腸癌、宮頸癌等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)機(jī)制密切相關(guān)，現(xiàn)階段關(guān)于口腔鱗癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析報(bào)道較少。故本文重點(diǎn)探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG 3 多態(tài)性與OSCC易感性的關(guān)系，分析與口腔鱗癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

資料和方法

1.臨床資料

選取2017 年2 月至2019 年2 月我院收治手術(shù)治療與病理資料完整的口腔鱗癌患者98 例作為研究對(duì)象（實(shí)驗(yàn)組），選取同期到我院體檢健康的群體86 例作為對(duì)照組，所有入選患者手術(shù)治療前，均未進(jìn)行過(guò)任何放療或新輔助化療；年齡18～65 歲；排除既往免疫缺陷、自身免疫疾病、肝炎、HIV 及其他已經(jīng)感染性疾病者。98 例口腔鱗癌患者中唇鱗狀細(xì)胞癌21 例，舌鱗狀細(xì)胞癌48 例，頰黏膜鱗狀細(xì)胞癌29 例；病理分級(jí)：I 級(jí)：24 例；Ⅱ級(jí)17；Ⅲ級(jí)31 例；Ⅳ級(jí)：26 例；TNM 分期參照UICC2002 口腔癌分期標(biāo)準(zhǔn)[7]：T1 期：41 例；T2 期：25 例；T3 期：20；T4 期12例；N0 期：45 例；N1-2 期：56 例。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但實(shí)驗(yàn)組中吸煙史、飲酒史明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。本研究所有入選患者均為自愿參與本研究，且簽署知情同意書，獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組基本資料比較

2.方法

收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙史飲酒史等一般資料，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素采用多元回歸模型調(diào)整變量因素，然后進(jìn)行IncRNA MEG3 基因多態(tài)性篩選，以dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)作為IncRNA MEG3 中SPNs 基因多態(tài)性篩查對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增及酶切觀察SPNs 多態(tài)性基因位點(diǎn)變化。

DNA 提取與基因型檢測(cè)：將所有研究對(duì)象外周血，經(jīng)離心分離處理獲得血漿與血細(xì)胞。血細(xì)胞標(biāo)本采用酚- 氯仿法提取DNA，完成提取后采用PCR-RFLR 基因分離技術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象的SNPs 基因型，PCR 擴(kuò)增引物是：5'-ACT-CAGGAATCGGCTC TGAAGGTG-3'，5'-GATGTGGTGGCTGGTGGTCAAC GT-3'。PCR 體系如下：總體積20μL，含有約100ng DNA 1μL；2×Es Taq Master Mix10μL；ddH 207μL；Primer-F，Primer-R 各1μL。

酶切：完成擴(kuò)增后采用5μl 通過(guò)Bg1I 內(nèi)切酶靜置過(guò)夜，給予3%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所有樣本酶切產(chǎn)物條帶位置測(cè)定，評(píng)估SNPs 位點(diǎn)基因分型，研究時(shí)選取10%樣本重復(fù)檢測(cè)確定不同分型結(jié)果。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS21.0 與student-t 檢驗(yàn)兩個(gè)軟件進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)，年齡、性別、吸煙與飲酒等資料采用χ2檢驗(yàn)，采用goodness-of-fitχ2檢測(cè)對(duì)照組是否符合Hardy-Weinberg 平衡。采用單因素及多因素logistics 回歸計(jì)算，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.兩組研究主體按照性別調(diào)整的吸煙率及飲酒率比較

本研究實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組性別形成男多女少差異，在吸煙率與飲酒率方面采用直接法比較，調(diào)整結(jié)果表示吸煙率與飲酒率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.IncRNA MEG3 基因多態(tài)性結(jié)果

本研究總共篩選得出7 個(gè)IncRNA MEG3 基因多態(tài)性相關(guān)的SNPs 的生物學(xué)信息，兩組在SPNs 中rs11160608 基因型頻率中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 兩組研究主體按照性別調(diào)整的吸煙率及飲酒率比較

3.PCR 擴(kuò)增及酶切

本研究中運(yùn)用PCR-RFLP 方法進(jìn)行位點(diǎn)基因型判斷，實(shí)驗(yàn)組DNA 通過(guò)擴(kuò)增與酶切后采取瓊脂糖凝膠電泳。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為445pb，采用Bg1I 內(nèi)切酶酶切后，根據(jù)酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果評(píng)估基因分型，SNPs 基因rs11160608A＞C 位點(diǎn)各基因型的擴(kuò)增條帶及酶切情況，AA 純合型突變基因型、AC 雜合型突變基因、CC 野生基因型，見圖1～3。

表3 IncRNA MEG3 基因多態(tài)性結(jié)果

圖1 SPNs 基因rs11160608AA 型基因測(cè)序圖

圖2 SPNs 基因rs11160608AC 型基因測(cè)序圖

圖3 SPNs 基因rs11160608CC 型基因測(cè)序圖

表4 SNPs 與OSCC 的相關(guān)性logistics 回歸分析

4.SNPs 與OSCC 的相關(guān)性分析

本研究結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、性別、吸煙與飲酒等相關(guān)因素后，SNPs 中rs11160608AC 型基因是與增加OSCC 風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，其他SNPs 未見與OSCC 風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。見表4。

5.rs11160608 多態(tài)性與OSCC 易感性分層分析

Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別為χ2＝3.514，P＝0.072 和χ2＝0.753，P＝0.518，表明研究對(duì)象具有群體代表性。將全部研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙史、飲酒史等變量納入logistics 回歸分析發(fā)現(xiàn)，在年齡＞50 歲與吸煙群體，rs11160608 易感性之間的關(guān)系在共顯性模型中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 rs11160608 多態(tài)性與OSCC 易感性logistics 回歸分層分析

討論

LncRNA MEG3 來(lái)源于人類染色體14q32.3 中的印記基因的一類，作為臨床報(bào)道中首個(gè)認(rèn)同具有腫瘤抑制效果的LnCRNA[8]。LncRNA MEG3 在大量正常組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，但在肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)為低表達(dá)，甚至部分未見表達(dá)，同時(shí)調(diào)控表達(dá)變化水平與腫瘤進(jìn)程與患者預(yù)后具有相關(guān)性[9，10]。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，吸煙、飲酒是大量惡性腫瘤的危險(xiǎn)因素，如食管鱗狀細(xì)胞癌、口腔癌與頭頸癌等[11，12]。本研究中采用對(duì)照組研究，利用性別進(jìn)行調(diào)整后，實(shí)驗(yàn)組吸煙率51.92%、飲酒率66.67%仍較對(duì)照組更高，與既往研究結(jié)果中煙酒攝入可能會(huì)增加OSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[13]。SPNs 基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成LncRNA MEG3，繼而通過(guò)表觀遺傳學(xué)修飾作用參與不同疾病發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮重要作用[14，15]。本文通過(guò)分析MEG3 中SPNs 基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，rs11160608 位點(diǎn)作為MEG3 基因中的關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)與不同疾病的易感性既往有大量臨床報(bào)道[16，17]；Li X 等[18]針對(duì)西方國(guó)家群體分析該基因位點(diǎn)與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系研究，結(jié)果得出未見該位點(diǎn)的等位基因或基因頻率在患者與正常對(duì)照組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lian Y 等[19]針對(duì)女性群體先兆子癇對(duì)照研究結(jié)果仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhang CG 等[20]研究中國(guó)漢族群體的胃癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系發(fā)現(xiàn)rs11160608 位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。本研究首次報(bào)道MEG3 中SNPs 基因多態(tài)性rs11160608 位點(diǎn)與漢族群體OSCC 風(fēng)險(xiǎn)間的相關(guān)性。rs11160608 多態(tài)性是MEG3 中的內(nèi)含子A＞C 變異，本研究重點(diǎn)分析MEG3 多態(tài)性對(duì)OSCC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，進(jìn)行分層分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)＞50 歲的群體與吸煙群體中的rs11160608 該位點(diǎn)AC 基因型明顯高于AA 與CC 型，提示該位點(diǎn)再特定群體中與OSCC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有關(guān)聯(lián)，但本研究仍需要深入分析，但因現(xiàn)階段相關(guān)的研究報(bào)道較少，展開對(duì)比驗(yàn)證頗有難度。

綜上所述，本研究通過(guò)病例與健康群體的對(duì)照研究， 分析了MEG4 中SNPs 基因多態(tài)性rs11160608 位點(diǎn)與OSCC 風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的AC 基因型攜帶者在老年群體與吸煙群體中患OSCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著更高，該結(jié)果提示MEG3 多態(tài)性與OSCC 風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，幫助對(duì)OSCC 疾病性發(fā)展的認(rèn)知。但由于本研究中納入樣本量較小，同時(shí)缺乏深入功能機(jī)理參考，后期應(yīng)加大樣本含量深入分析。