楊 帆 張飛燕 孫勁沖 劉 雙 劉洪偉 張麗萍* 胡 濱

（1 河北工業(yè)大學化工學院，天津 300130；2 河北省科學院生物研究所，河北石家莊 050081；3 河北省畜牧站，河北石家莊 071000）

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實施，我國馬鈴薯栽培面積持續(xù)擴大，由于輪作倒茬困難，土壤中的優(yōu)勢致病菌不斷積累（劉高遠 等，2014），枯萎病、黑痣病、晚疫病等病害逐年加重，而且常?；旌习l(fā)生，已經(jīng)成為影響馬鈴薯品質(zhì)以及導致馬鈴薯嚴重減產(chǎn)的重要因素（王穎 等，2014）。目前馬鈴薯真菌病害主要以化學防治為主，由于藥劑的用量與使用種類逐年增加，造成了病原菌產(chǎn)生耐藥性、殺菌劑殘留以及環(huán)境污染等問題（路粉和王文橋，2017）。采用持續(xù)、高效、環(huán)保的方法控制病害越來越受到人們的重視，生物防治是解決這些問題的有效途徑（Palaniyandi et al.，2013）。目前篩選到的拮抗菌株主要針對1種或2種馬鈴薯真菌病害，Sharma 等（2015）篩選到1株枯草芽孢桿菌V26，可有效抑制立枯絲核菌在馬鈴薯根部的定殖，使馬鈴薯黑痣病的發(fā)病率降低；張紊瑋等（2018）篩選到假單胞菌YL11對硫色鐮刀菌具有較強的拮抗活性；楊繼業(yè)等（2018）篩選到1株對茄鏈格孢菌有較強抑制作用的解淀粉芽孢桿菌BAF-6。但是生產(chǎn)應用中往往難以應對多種病害混合發(fā)生的情況，篩選抑菌譜寬且對同一種作物多種病原真菌具有較強拮抗作用的生防菌株是今后的研究重點。

河北省科學院生物研究所微生物實驗室前期篩選到1株高效廣譜的生防菌株BA-26，本試驗擬通過形態(tài)特征、生理生化特性并結(jié)合16S rDNA 同源序列分析對其進行分類鑒定；明確該菌株對馬鈴薯多種病原菌的抑菌譜及抑菌效果；研究胞外代謝產(chǎn)物特性并驗證其對馬鈴薯的防病促生作用，以期為研制新型生防制劑提供前期工作基礎，同時為馬鈴薯真菌病害的生物防治提供有效的方法。

1 材料與方法

試驗于2018年3～11月在河北省科學院生物研究所微生物實驗室進行。

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株BA-26及病原菌來源 菌株BA-26由河北省科學院生物研究所微生物室分離并保藏；馬鈴薯病原菌名稱及來源見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株BA-26的保存和活化均使用PB 培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為NB 培養(yǎng)基，裝液量均為300 mL 三角瓶中裝入50 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基分為NB 培養(yǎng)基和解淀粉優(yōu)化培養(yǎng)基，裝液量均為500 mL 三角瓶中裝入100 mL。馬鈴薯盆栽試驗發(fā)酵液制備采用芽孢桿菌優(yōu)化培養(yǎng)基：0.08% 酵母膏，0.1%（NH4）2SO4，0.075% 檸檬酸鈉，0.05% KH2PO4，0.03% MgSO4，0.01% MnSO4，玉 米 粉2.6%，蔗糖0.45%，豆餅2.4%，魚粉0.3%，0.75% CaCO3，去離子水配制，pH 7.3～7.5。試驗中所用到的病原真菌均使用PDA 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌株BA-26 16S rDNA 序列擴增與分析中菌株的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基。

1.1.3 菌株BA-26無菌濾液的制備 將斜面保存的BA-26菌株劃線接種于種子培養(yǎng)基，置于32 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)17 h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接于NB 發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床設置同上，培養(yǎng)36 h，血球平板計數(shù)可知發(fā)酵液菌含量約為7.0×108cfu ·mL-1。離心后收集上清液，經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾后即為無菌濾液，4 ℃保存。

1.1.4 盆栽試驗菌株BA-26發(fā)酵液的制備 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)同1.1.3，以5%的接種量轉(zhuǎn)接于芽孢桿菌優(yōu)化培養(yǎng)基中，置于32 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)48 h，血球平板計數(shù)可知發(fā)酵液菌含量約為4.0×109cfu·mL-1，顯微鏡觀察確保產(chǎn)生整齊的芽孢。1.1.5供試馬鈴薯 供試馬鈴薯品種為費烏瑞它，由河北省春華馬鈴薯種植有限公司提供。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征 在PB 平板上接種菌株，32 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌株菌落形態(tài)，復紅染色后于顯微鏡下鏡檢。菌株生理生化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進行鑒定。

1.2.2 16S rDNA 序列擴增與分析 將BA-26單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中，置于32 ℃、180 r·min-1搖床中培養(yǎng)17 h，采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，利用16S rRNA 細菌通用引物27F/1492R 擴增目的片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast 分析比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 室內(nèi)抑菌活性測定

將90 mL PDA 培養(yǎng)基與10 mL 菌株BA-26無菌濾液混合均勻，制成含無菌濾液培養(yǎng)基平板，每個平板混合培養(yǎng)基的用量為30 mL，在平板中心接入直徑為9 mm 的病原菌菌餅，每種病原菌為1個處理，每處理3次重復。以10 mL 無菌水和90 mL PDA 培養(yǎng)基混合為對照，待對照長滿平板（平板直徑9 mm）后，測量處理組病原菌菌落直徑，計算抑菌率（胡忠亮 等，2017）。以立枯絲核菌、燕麥鐮刀菌等8種馬鈴薯病原菌為測試菌株，采用生長速率法測定抑菌率。

抑菌率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/（對照菌落生長直徑-菌餅直徑）×100%

1.4 BA-26胞外代謝產(chǎn)物特性

1.4.1 熱穩(wěn)定性 將BA-26無菌濾液置于1.5 mL EP 管中，分別在恒溫金屬浴上60、70、80、90、100 ℃處理30 min，選取1支置于滅菌鍋中121 ℃處理30 min，以不做處理為對照，使用平板對峙法測定各處理和對照抑菌直徑，以對照的抑菌圈大小為活性100%，計算各處理對茄病鐮刀菌的相對抑菌率，每處理3次重復。

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性 用1 mol·L-1的鹽酸和1 mol ·L-1的氫氧化鈉將BA-26無菌濾液的pH 分別調(diào)節(jié)為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，以不做處理為對照。室溫下放置1 h 后調(diào)節(jié)pH 為7，測定其對茄病鐮刀菌的抑菌活性，每處理3次重復，各處理相對抑菌率計算方法同1.4.1。

1.4.3 紫外照射穩(wěn)定性 將BA-26無菌濾液置于距離20 W 的紫外燈15 cm 處分別照射2、4、6、8 h，以不做處理為對照，測定其對茄病鐮刀菌的抑菌活性，每處理3次重復，各處理相對抑菌率計算方法同1.4.1。

1.4.4 蛋白酶處理穩(wěn)定性 用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K 分別與無菌濾液37 ℃反應1 h，反應濃度均為1 mg·mL-1。以不做處理為對照，測定其對茄病鐮刀菌的抑菌活性，每處理3次重復，各處理相對抑菌率計算方法同1.4.1。

1.5 菌株BA-26的防病作用

選取大小一致且無病蟲感染的馬鈴薯塊莖清洗干凈，用1% NaClO 表面消毒5 min，無菌水沖洗后再用75%乙醇消毒。在無菌操作室將塊莖切成厚約1 cm 的薄片，置于BA-26無菌濾液中處理15 min，在薄片表面中心位置接種直徑為9 mm 的茄病鐮刀菌菌餅，以滅菌的NB 培養(yǎng)液為對照，每處理3次重復。抑制率的計算方法同1.3。

1.6 菌株BA-26的促生作用

試驗在河北省科學院生物研究所溫室中進行，盆栽種植土以營養(yǎng)土和蛭石1∶1（體積比）混合，121 ℃滅菌3 h，種植盆盆口外徑19 cm，深15 cm，每盆種植土用量為400 g。脫毒種薯于人工氣候箱催芽至1 cm 左右后在散射光下壯芽，挑選長勢一致的種薯切塊播種，每盆種1株。試驗共設3個處理，播種后在土壤中分別澆灌濃度為4.0×109cfu·mL-1BA-26發(fā)酵液10、20、30 mL，每處理30株，2018年10月播種，出苗7 d 時，各處理隨機挖取5株調(diào)查須根數(shù)、須根長；出苗30 d 時，各處理隨機挖取5株測定株高、莖粗和葉綠素含量（李芬，2011）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

釆用MEGA 5.0軟件對所篩菌株進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，并用GraphPad.Prism.v7.0軟件進行圖形繪制和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 菌株BA-26的形態(tài)特征 菌株BA-26在PB培養(yǎng)基上生長迅速，早期菌落形態(tài)呈白色，表面扁平、光滑，邊緣整齊近圓形，生長后期菌落不透明，開始向中間聚攏并呈火山狀凸起，邊緣不規(guī)則呈褶皺狀態(tài)（圖1），菌體呈桿狀，長約2.3 μm，寬約0.7 μm（圖2），革蘭氏染色陽性，芽孢中生，呈橢圓形。

2.1.2 菌株BA-26的生理生化特性 對菌株BA-26進行生理生化特性鑒定（表2），初步鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

2.1.3 菌株BA-26的分子生物學鑒定 菌株BA-26的16S rDNA 序列長度為532 bp（圖3），尚未在NCBI 備案，通過BLAST 軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，選取具有較高同源性的模式菌株，通過MEGA 軟件采用鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可見菌株BA-26與Bacillus amyloliquefaciens strainMd1-43高度相近，結(jié)合形態(tài)特征將其鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖1 BA-26的菌落形態(tài)

圖2 BA-26的菌體形態(tài)

表2 菌株BA-26的生理生化指標

2.2 菌株BA-26的抑菌譜測定

從表3和圖5可以看出，菌株BA-26的無菌濾液對茄鏈格孢菌、立枯絲核菌等8種馬鈴薯病原真菌均有較強抑制作用，其中對茄鏈格孢菌、燕麥鐮刀菌、茄病鐮刀菌的抑菌率均達80%以上；對接骨木鐮刀菌和三線鐮刀菌的抑菌率均在68%以上。可見BA-26能有效抑制多種馬鈴薯病原真菌，具有防治多種馬鈴薯真菌病害混合發(fā)生的潛力。

圖3 菌株BA-26的16S rDNA 序列

圖4 菌株BA-26的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株BA-26胞外代謝產(chǎn)物性質(zhì)

2.3.1 熱穩(wěn)定性 菌株代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性會影響生防菌劑的加工及其田間效果的發(fā)揮。如圖6所示，菌株BA-26無菌濾液經(jīng)100 ℃處理30 min，對茄病鐮刀菌的相對抑菌率保持在90%以上。經(jīng)121 ℃處理30 min 后，相對抑菌率仍維持在70%以上，可見其代謝產(chǎn)物具有較強的熱穩(wěn)定性。

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性 如圖7所示，菌株BA-26胞外代謝產(chǎn)物在pH 為2～10的環(huán)境中處理1 h 后，對茄病鐮刀菌的相對抑菌率均在80%以上。pH 為11時，相對抑菌率開始下降至50%左右。表明菌株BA-26代謝產(chǎn)物具有較強的酸堿穩(wěn)定性，在實際生產(chǎn)與應用中可適應的酸堿范圍較廣。

表3 BA-26無菌濾液對病原菌的抑菌率

圖5 BA-26無菌濾液的抑菌效果

圖6 菌株BA-26的熱穩(wěn)定性

圖7 菌株BA-26的酸堿穩(wěn)定性

圖8 菌株BA-26的紫外照射穩(wěn)定性

2.3.3 紫外照射穩(wěn)定性 如圖8所示，在試驗照射時間范圍內(nèi)，隨著紫外照射時間的延長，代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性緩慢下降，照射8 h 后對茄病鐮刀菌的相對抑菌率仍達85%，表明其具有較強的紫外照射穩(wěn)定性。

2.3.4 蛋白酶處理穩(wěn)定性 菌株BA-26胞外代謝產(chǎn)物經(jīng)1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶37 ℃處理1 h 后，相對抑菌率分別為89.2%、89.2%和93.5%，說明BA-26胞外代謝產(chǎn)物對蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，具有較強的蛋白酶穩(wěn)定性，可能含有肽類或脂肽類等物質(zhì)。

2.4 菌株BA-26的防病作用

如圖9所示，BA-26無菌濾液可顯著抑制茄病鐮刀菌病斑的擴散。對照病斑從薯塊中心位置向四周蔓延并呈水漬狀浸染，中心部位向內(nèi)凹陷表明病原菌已經(jīng)侵入馬鈴薯內(nèi)部。接種第5天，病斑平均直徑為3.2 cm；而BA-26無菌濾液處理的病原菌縱向和橫向的侵染均受到明顯抑制，菌落平均直徑1.1 cm，對馬鈴薯茄病鐮刀菌的抑制率為91.3%，可有效預防茄病鐮刀菌對馬鈴薯塊莖的侵染。

2.5 菌株BA-26的促生長作用

盆栽試驗結(jié)果表明（圖10、表4），不同用量的BA-26發(fā)酵液對馬鈴薯植株的根系有明顯促生作用。施用10、20、30 mL 發(fā)酵液處理后，馬鈴薯根長分別比對照增加了7.03%、32.07%、21.89%，其中20 mL 和30 mL 處理較對照差異顯著；須根數(shù)分別比對照顯著增加73.97%、111.94%、83.98%。

圖9 BA-26離體防病試驗結(jié)果

圖10 BA-26對馬鈴薯根系的影響

表4 BA-26發(fā)酵液對馬鈴薯根系生長的影響

從表4還可以看出，20 mL BA-26發(fā)酵液處理對馬鈴薯株高和葉綠素含量均具有顯著促進作用，分別較對照增加了48.0%和19.6%；不同用量的BA-26發(fā)酵液對馬鈴薯莖粗影響不顯著。

3 結(jié)論與討論

真菌病害嚴重制約著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生防微生物對環(huán)境友好、可誘導相關(guān)防御酶提高植物的抗病能力、減少土壤中致病菌的積累，是解決這一問題的重要生防資源?，F(xiàn)有生防菌株多對1種或2種馬鈴薯真菌病害有較好的防效，存在生防能力單一、應用范圍窄等問題，往往無法應對馬鈴薯真菌病害混合發(fā)生的情況，亟須篩選鑒定高效廣譜抗馬鈴薯真菌病害的生防菌株。芽孢桿菌由于可以產(chǎn)生抗逆芽孢、代謝產(chǎn)物抗菌物質(zhì)豐富、降解農(nóng)藥殘留（宋勝男 等，2018），是一類具有較大應用價值的生防菌株，王穎等（2014）發(fā)現(xiàn)死谷芽孢桿菌263XY1對馬鈴薯貯藏期壞疽病菌、炭疽病菌和枯萎病菌具有較強的拮抗作用；暢濤等（2014）發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌ZA1對馬鈴薯炭疽病菌、褐腐病菌和干腐病菌具有較強的抑制作用，本試驗鑒定出1株對馬鈴薯黑痣病菌、干腐病菌、早疫病菌等8種病原真菌具有較強拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌。該菌株對馬鈴薯真菌病害抑菌譜更寬，對貯藏期和苗期的主要馬鈴薯真菌病害均表現(xiàn)出較強的拮抗活性。

生防菌主要通過代謝產(chǎn)物防治植物病害，因此代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性研究對于以其為核心的生物制劑的生產(chǎn)和田間應用具有重要的意義，周國旺等（2015）研究發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌BtLTS290經(jīng)121℃處理后仍有抑菌活性，在pH 3～11、蛋白酶K 處理后活性基本不變；胡忠亮等（2017）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HZM9代謝產(chǎn)物經(jīng)100 ℃處理30 min 后，抑菌率下降到66.55%，pH 5～9的酸堿處理穩(wěn)定性強，紫外照射和蛋白酶處理穩(wěn)定性強。本試驗中，菌株BA-26代謝產(chǎn)物對紫外照射和蛋白酶處理不敏感，與以上研究結(jié)果相似，經(jīng)pH 2～10的酸堿處理和121 ℃加熱30 min 后，抑菌率分別保持在80%和70%以上，較上述菌株熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性更強，可見BA-26分泌的抗菌物質(zhì)能更好地適應特殊的生境，應用范圍更廣。

芽孢桿菌還可通過分泌生長激素、溶磷作用、產(chǎn)鐵載體等機制促進植物的生長。崔文艷等（2018）研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Y2發(fā)酵液可使玉米株高、根長、葉寬、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別增加28.29%、27.21%、18.56%、80.93%、66.67%；邢芳芳等（2016）研究表明枯草芽孢桿菌PSM 菌劑可使普通白菜葉綠素和可食用葉片數(shù)分別較空白對照增加5.13%和25.86%。本試驗發(fā)現(xiàn)，每盆施 用20 mL 濃 度為4.0×109cfu·mL-1的BA-26發(fā)酵液使馬鈴薯根長、須根數(shù)、株高分別顯著增加32.07%、111.94%、48.0%，植株能更好地抵抗病原菌的侵染，應對不利環(huán)境的脅迫。同時，葉片中葉綠素含量顯著提高19.6%，葉片中葉綠素含量是植株健康的重要表征指標，與植物抗病性有直接的關(guān)系（顧振芳 等，2004）。

本試驗明確了菌株BA-26作為馬鈴薯專用生防菌劑的巨大潛力及進一步開發(fā)應用的價值，對后續(xù)植物真菌病害生防菌株的篩選、鑒定及研究具有重要的指導意義。