趙艷杰 馮艷芳 黃思思 馬瑩雪 李嬡嬡 張 蝶 鄧 超 韓瑞璽 唐 浩

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176）

近年來，隨著人們品種權(quán)意識(shí)的日益增強(qiáng)，且《種子法》中要求品種登記、審定、保護(hù)均需要通過特異性（可區(qū)別性，Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）的測試（簡稱DUS測試），因此植物品種DUS 測試工作任務(wù)量不斷加大，加之我國培育、審定和保護(hù)大豆新品種速度的加快，大豆骨干親本的使用使得品種間的遺傳多樣性降低，單純依據(jù)表型性狀進(jìn)行品種田間檢驗(yàn)越來越困難，因此對(duì)DUS 測試技術(shù)的要求越來越高[1]。以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA 指紋鑒定技術(shù)具有準(zhǔn)確可靠、簡單快速的優(yōu)點(diǎn)，指紋圖譜是鑒別品種的有力工具[2]，因此建立以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA 指紋圖譜能夠?yàn)樘禺愋裕蓞^(qū)別性）判定時(shí)輔助篩選近似品種和解決品種糾紛提供技術(shù)支持。

我國在大豆DNA 指紋圖譜構(gòu)建方面取得了一定的成果，田清震[3]利用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)，建立了我國代表性野生大豆和栽培大豆種質(zhì)的指紋圖譜。趙洪錕等[4]利用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建了64 份吉林省大豆骨干親本及主推品種的DNA 指紋圖譜。高明[5]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了89 個(gè)吉林省推廣大豆品種的DNA 指紋圖譜，并進(jìn)行遺傳多樣性分析。徐海風(fēng)等[6]用45 對(duì)SSR 引物對(duì)43 份大豆品種（系）進(jìn)行遺傳相似性分析，并構(gòu)建指紋圖譜。陳亮等[7]從320 對(duì)SSR 標(biāo)記引物中篩選出由7個(gè)SSR 標(biāo)記構(gòu)建了吉林省新育成大豆品種的DNA指紋圖譜。徐冬雪等[8]以參加2016 年河北省區(qū)域試驗(yàn)的21 個(gè)大豆品系為材料，用62 對(duì)SSR 引物構(gòu)建了指紋圖譜。而針對(duì)東北地區(qū)申請(qǐng)保護(hù)大豆品種DNA 指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析還未見報(bào)道。

截止到2018 年11 月份，東北地區(qū)受保護(hù)的大豆品種數(shù)量占將近一半，本研究利用均勻分布于大豆染色體的40 對(duì)SSR 引物，對(duì)東北地區(qū)已獲得植物新品種權(quán)的182 份大豆品種進(jìn)行遺傳分析，同時(shí)構(gòu)建其DNA 指紋圖譜庫，為DUS 測試中輔助篩選近似品種和解決品種糾紛奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料182 份來自東北地區(qū)申請(qǐng)植物新品種保護(hù)大豆授權(quán)品種（表1）。

1.2 DNA 提取從每個(gè)品種中取50 粒種子，放在裝有適量濕沙土的發(fā)芽盒內(nèi)于人工氣候培養(yǎng)箱發(fā)苗，每個(gè)樣品隨機(jī)取葉片20 片以上，液氮研磨后，用改良的CTAB 法提取種子DNA[9]。

1.3 SSR 標(biāo)記檢測及數(shù)據(jù)分析品種區(qū)分效果好、峰型易讀的40 對(duì)SSR 引物由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所推薦（表2），熒光引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR 體系含1×TaqMan?Gene Expression Master Mix、30ng DNA，加ddH2O 補(bǔ)足20μL。95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s～1min 30s，共32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10～15min，16℃條件下保存。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，取1μL 稀釋液加8.5μL 去離子甲酰胺、0.5μL Liz-500 分子量內(nèi)標(biāo)，于ABI 3730DNA 分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。利用北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米中心開發(fā)的SSR 指紋分析器采集擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小。采用Powermarker V3.25 軟件進(jìn)行聚類分析，用Figtree 模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 標(biāo)記多態(tài)性分析分析182 份大豆品種40 對(duì)SSR 引物標(biāo)記多態(tài)性，共擴(kuò)增出266 種多態(tài)性基因型，每對(duì)引物的基因型表現(xiàn)從4～20 種不等，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出11.05 種基因型。

2.2 遺傳多樣性分析利用Powermarker V3.25軟件進(jìn)行遺傳相似性分析，結(jié)果表明，182 個(gè)大豆品種間遺傳相似系數(shù)的變化范圍是0.4887（黑交00-1152 與野褐1 號(hào)）～1.0000（龍墾335、合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)），平均為0.7785。從聚類分析結(jié)果（圖1）來看，182 份大豆品種可聚合為13 大類，龍墾331 單獨(dú)為一類；墾豐16、墾豆26 號(hào)、墾豆38、墾豆37、墾豆28、墾豆36、墾豆39、墾豆33 聚合在一起；黑農(nóng)70、黑農(nóng)64、黑農(nóng)68、黑農(nóng)66、黑農(nóng)69 聚合在一起，說明上述8 個(gè)墾豆系列品種和5個(gè)黑農(nóng)系列品種遺傳基礎(chǔ)較窄。除此之外，合農(nóng)系列、吉育系列、綏農(nóng)系列品種分布較遠(yuǎn)，說明遺傳基礎(chǔ)較遠(yuǎn)。

龍墾335、合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)具有相同的DNA指紋，查詢DUS 測試數(shù)據(jù)庫中3 個(gè)品種的田間表型數(shù)據(jù)，合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)在“下胚軸：花青甙顯色強(qiáng)度”等5 個(gè)性狀上有1 個(gè)代碼差異，表型相近，合農(nóng)75 和龍墾335 在“莖：茸毛密度”等14 個(gè)性狀上有1～3 個(gè)代碼差異，表型差異較大（表3）。

3 討論

大豆是高度自交結(jié)實(shí)作物，遺傳基礎(chǔ)狹窄。邱麗娟[10]發(fā)現(xiàn)18 個(gè)美國大豆品種提供了美國85%的育成品種的遺傳物質(zhì)。崔章林[11]分析了中國651 個(gè)大豆品種的系譜，認(rèn)為中國東北、黃淮海地區(qū)和南方3 大產(chǎn)區(qū)衍生品種最多僅38 個(gè)祖先親本。本研究利用40 對(duì)SSR 引物對(duì)182 份東北地區(qū)已授植物新品種保護(hù)權(quán)的品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其平均相似系數(shù)為0.7785，遺傳基礎(chǔ)較窄，又由于育種采用大豆品種同質(zhì)化嚴(yán)重，加大了DUS 測試中特異性鑒定的難度。除此之外，8 個(gè)墾豆系列品種和5 個(gè)黑農(nóng)系列品種緊密聚合在一起，說明同一育種單位育成的新品種遺傳多樣性低，因此在大豆的新品種選育上可考慮拓寬遺傳基礎(chǔ)。

表1 182 份來自東北地區(qū)申請(qǐng)植物新品種保護(hù)大豆授權(quán)品種

表2 SSR 標(biāo)記引物

圖1 182 份東北地區(qū)申請(qǐng)保護(hù)大豆品種UPGMA 聚類圖

《種子法》中規(guī)定“農(nóng)業(yè)、林業(yè)主管部門可以采用國家規(guī)定的快速檢測方法對(duì)生產(chǎn)經(jīng)營的種子品種進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果可以作為行政處罰依據(jù)”。由于基因與性狀的關(guān)系并不都是簡單的線性關(guān)系，基因與基因、基因與基因產(chǎn)物、基因與環(huán)境之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系，分子檢測結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果也無必然關(guān)聯(lián)。本研究中，龍墾335、合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)DNA 指紋相同，合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)表型相近，說明了構(gòu)建大豆DNA 指紋數(shù)據(jù)庫在特異性（可區(qū)別性）判定時(shí)輔助篩選近似品種具有一定的參考意義；合農(nóng)75 和龍墾335 表型差距較大，說明品種特異性（可區(qū)別性）的最終判定不能僅僅依靠分子鑒定，還需要依靠田間種植對(duì)比試驗(yàn)。

表3 龍墾335、合農(nóng)75 和合豐50 號(hào)的田間鑒定結(jié)果