李佳　段真真　楊世忠　何宗霖

摘要 ? ?為研究阿克蘇地區(qū)牛感染環(huán)形泰勒蟲情況，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對519份牛血液樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，牛感染環(huán)形泰勒蟲病發(fā)生率為14.6%，其中舍飼和散養(yǎng)牛感染率分別為12.6%和15.0%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.17，p>0.05）。由此表明，阿克蘇地區(qū)是牛環(huán)形泰勒蟲流行地區(qū)，有關(guān)部門應(yīng)采取相應(yīng)的措施，降低發(fā)生牛環(huán)形泰勒蟲病疫情的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞 ? ?環(huán)形泰勒蟲;實(shí)時(shí)熒光PCR;流行病學(xué);調(diào)查;新疆阿克蘇

中圖分類號 ? ?S855.9 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）19-0219-01 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

牛環(huán)形泰勒蟲病是由泰勒科泰勒屬的環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）寄生于牛紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲病，病原主要通過媒介蜱蟲傳播，臨床上主要表現(xiàn)為稽留熱、黃疸、貧血及體表淋巴結(jié)腫大等癥狀[1-2]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重危害。我國自1960年首次發(fā)現(xiàn)環(huán)形泰勒蟲病以來，相繼在寧夏、河北、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古等地報(bào)道了該病的存在[3-4]。牛環(huán)形泰勒蟲病長期危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，感染環(huán)形泰勒蟲的牛多呈帶蟲免疫，少有發(fā)病。沙塔爾等[5]報(bào)道的吐魯番地區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲病感染率為51.6%。養(yǎng)牛業(yè)是阿克蘇地區(qū)農(nóng)牧民實(shí)現(xiàn)致富增收的重要途徑之一，為了解阿克蘇地區(qū)牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況，為掌握該病的流行狀況及為防治提供數(shù)據(jù)支持，本試驗(yàn)對該地區(qū)隨機(jī)采取的519份抗凝血進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?主要試劑

全血DNA提取試劑盒、Premix Ex Taq、聚合酶等均購自大連寶生物工程有限公司;引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;實(shí)時(shí)熒光定量7 500 PCR儀購自ABI。

1.2 ? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ? ?樣品采集。2017—2018年，從阿克蘇地區(qū)轄內(nèi)9個(gè)縣（市）隨機(jī)采樣，無菌采集519頭牛抗凝血，提取全血基因組DNA，-20 ℃保存待檢。

1.2.2 ? ?實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。利用已報(bào)道的牛環(huán)形泰勒蟲的特異性引物和探針[6]，序列如下。TAF：5′-AATTTCTGCTGC-ATTGCTTG-3′。TAR：5′-GTAAACATTCAGACAAAGAAACT-CC-3′。TAP：5′-FAM-CCTCTGGGGTCTGTGCATGTGG-TA-MRA-3′。以提取的519份牛核酸樣品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系均為25 μL：Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物（10 μmoL）各1 μL，探針（10 μmoL）0.75 μL，模板1 μL，ROX Ⅱ 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性15 s、57 ℃變性45 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)最后一步檢測熒光信號。

1.3 ? ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0分析軟件對調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況，采用χ2檢驗(yàn)比較檢測數(shù)據(jù)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果

對提取的519份核酸樣品經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，感染率為14.6%（76/519）（圖1）。

2.2 ? ?不同地區(qū)牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況

對阿克蘇地區(qū)9個(gè)縣（市）隨機(jī)采集的519份樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，9個(gè)縣（市）檢測結(jié)果見表1。可以看出，各縣（市）牛均有感染環(huán)形泰勒蟲病情況，各縣（市）間牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.12～41.77，p<0.05）。

2.3 ? ?不同飼養(yǎng)方式牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況

519份核酸樣品經(jīng)PCR檢測，不同飼養(yǎng)方式的牛感染環(huán)形泰勒蟲病的情況見表2?？梢钥闯?，舍飼和散養(yǎng)條件下的牛均可感染環(huán)形泰勒蟲病，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.17，p>0.05）。

3 ? ?討論

目前，基層獸醫(yī)部門檢測環(huán)形泰勒蟲病主要還是以血液涂片染色鏡檢為主，很少用到分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法，血液涂片染色鏡檢受制于操作人員操作技能、專業(yè)知識儲備和染色技術(shù)，漏檢、誤檢情況較普遍。分子生物學(xué)方法比血液涂片染色鏡檢更靈敏、特異，適合應(yīng)用于高通量檢測[7]。牛在自然感染下，往往是帶蟲免疫，一旦感染將很難根除[8]。

本次調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿克蘇地區(qū)9個(gè)縣（市）的牛均有感染牛環(huán)形泰勒蟲病的情況，縣（市）之間感染情況差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.12～41.77，p<0.05），可能是由于各縣（市）地理環(huán)境、海拔、氣候不同，導(dǎo)致當(dāng)?shù)仳缦x種群數(shù)量存在差異所致[9]。不同飼養(yǎng)條件下牛感染環(huán)形泰勒蟲病情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.17，p>0.05），導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能有以下3種：一是舍飼牛場周圍常有放牧羊出沒，牛場圈舍是不完全封閉的，放牧羊身上的蜱蟲掉落后進(jìn)入牛場圈舍內(nèi)叮咬舍飼牛;二是牛場圈舍針對性消毒措施不夠完善，散養(yǎng)牛羊混合飼養(yǎng)情況十分普遍，交叉感染情況普遍;三是牛場購入飼草料時(shí)將附著在飼草料上的蜱蟲一并帶回。

調(diào)查結(jié)果表明，阿克蘇地區(qū)是牛環(huán)形泰勒蟲病的流行地區(qū)，對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)牛業(yè)造成了一定的影響，有關(guān)部門應(yīng)采取相應(yīng)的措施，降低發(fā)生牛環(huán)形泰勒蟲病疫情的風(fēng)險(xiǎn)。

4 ? ?參考文獻(xiàn)

[1] 胡詩悅，錢年超，王軼男，等.延邊地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（6）：647-650.

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[7] 陳秋語，羅金，陳澤，等.新疆伊犁哈薩克自治州蜱及牛羊蜱傳病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2016，24（3）：72-77.

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[9] 圖爾蓀·薩迪爾，李佳，王振寶，等.新疆昭蘇縣馬梨形蟲的檢測及傳播媒介蜱的鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（7）：44-48.