張永麗 袁偉 楊清香

（河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007）

目前抗生素污染導致嚴重的環(huán)境問題［1］，包括生態(tài)風險和人類潛在的健康風險［2］。四環(huán)素（Tetracycline，TC）作為一大類被廣泛使用的抗生素，占總抗生素使用量的29%［3］，并且在臨床上超過70%的四環(huán)素以活性形式被釋放到環(huán)境中［1］。美國在139條河流中有一半都檢測到了TC的存在［4］，并且不同地點樣品中TC含量也有較大差別［5］。洪波等［6］用高效液相（HPLC-UV）技術測定水樣品中的四環(huán)素類、喹諾酮類等6種抗生素，檢測限（Limit of detection ，LOD）為 2.00-8.00 μg/kg。在不同環(huán)境樣品中的土霉素和四環(huán)素含量也有報道，其LOD分別為0.08和9 μg/kg［7］，同時在食品樣品中TC檢出量為5-25 μg/kg［8］，兩者遠遠低于微生物學抑菌實驗中 TC 的 LOD（25 μg/kg）［9］，但在江蘇省的牛糞中TC檢出量達到了0.52 mg/kg［10］。孫剛等［11］研究結果表明，雞糞中土霉素含量高達11.25 mg/kg，超過了TC的平均含量（0.58 mg/kg）。根據(jù)歐盟的法規(guī)，抗生素的環(huán)境濃度應在10 μg/kg以下，目前對于四環(huán)素和四環(huán)素衍生物的評估濃度在450-900 μg/kg范圍內(nèi)，比歐盟規(guī)定濃度高了約45-90倍［12］。抗生素的超規(guī)定濃度的暴露造成了環(huán)境中微生物的耐藥性，而抗生素耐藥菌是否對其他環(huán)境暴露毒性因子（如納米材料）有抗性還知之甚少。

納米材料［13-14］作為新型污染物，其造成的污染已逐步成為嚴峻的環(huán)境問題［15］，在土壤和水中均被檢出［16］。污水處理廠中產(chǎn)生的污泥、納米農(nóng)藥的應用、納米誘導的土壤修復和擴散排放等都造成了土壤環(huán)境中納米材料的殘留［16］；同時在市政污水中也檢測到了納米材料的存在［10］。納米材料的暴露會對微生物造成毒性，其中TiO2-NPs的抑菌原理研究較為清楚，TiO2-NPs經(jīng)光照接觸微生物，光照后在其表面產(chǎn)生活性氧物質（ROS）（如羥自由基，超氧根離子和過氧化氫），最終導致微生物的超氧化［17-18］。同時TiO2-NPs存在尺寸效應，它的毒性隨粒徑變化而變化，較小的顆粒會更容易聚集，從而導致與細胞接觸的表面積增加，更有利于其在細胞上的附著并抑制細胞內(nèi)和細胞外物質運輸［19］，甚至可能導致細胞代謝的中斷或死亡［20］，這些研究表明TiO2-NPs對微生物存在很強的毒性。另一方面，環(huán)境中大腸桿菌比枯草芽孢桿菌對TiO2-NPs更敏感［21］，表明大腸桿菌更容易受到TiO2-NPs的傷害。目前對于耐藥大腸桿菌的抗性機制研究，多數(shù)是從抗生素的種類和濃度著手，忽略了其他環(huán)境因子的影響。本研究以敏感菌和耐藥菌為實驗對象，探究了納米TiO2和四環(huán)素對大腸桿菌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為從雞糞中分離出的大腸桿菌（M13），由本實驗室保存。質控大腸桿菌ATCC25922購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。納米二氧化鈦，購自上海麥克林生化科技有限公司（Macklin Biochemical Co.Ltd），Bioscreen C（全自動生長曲線分析儀）來自芬蘭Bio-screen公司，F(xiàn)E-SEM（場發(fā)射掃描電鏡）型號為SIGMA500。

1.2 方法

1.2.1 耐藥性測試 根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）手冊，選用了16種抗生素研究耐藥大腸桿菌的耐藥性，如表1所示。藥敏試驗采用紙片擴散法（藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司），將Escherichia coliATCC25922 作為對照菌株，大腸桿菌M13作為實驗菌株。實驗過程依據(jù)CLSI操作，菌液利用比濁管校正OD600=0.6，利用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑每個測3次，取平均值。

1.2.2 Bioscreen C測定生長曲線 TiO2-NPs配制的終濃度分別為125、250、500、1000、2000、4 000mg/L，命名為 Ti1、Ti2、Ti3、Ti4、Ti5、Ti6；TC 配制的濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/L，命名為TC1、TC2、TC3、TC4、TC5、TC6。 生 長 曲 線 的 測 定方法參照之前的研究［22］，將質控菌ATCC25922和M13分別接種到LB培養(yǎng)液中，接菌量為5%，總體系為250 μL，每個樣品3個平行。本實驗采用的是Bioscreen C，內(nèi)裝2塊微孔板共200個孔，每孔的容積為400 μL，在600 nm下進行測樣。其參數(shù)設定：37℃，150 r/min，40 h，每20 min測定一次OD值。

選取Bioscreen C測出的數(shù)據(jù)，通過下式計算TiO2-NPs和TC對兩菌株的抑菌率［23］：

式中：Xs為抑菌率，A表示空白菌液吸光度值，B表示樣品菌液吸光度值。

1.2.3 FE-SEM實驗方法 按照場發(fā)射電鏡制備方法對樣品進行預處理，處理方法參照Jeon等［24］的研究，將質控菌ATCCC25922和M13接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期。取菌液在3000 r/min離心3 min收集菌體，PBS清洗2-3次，加入4%的戊二醛靜置過夜，離心去上清，PBS清洗2-3次后進行乙醇梯度脫水，最后用適量的100% 叔丁醇懸浮菌體，樣品預處理之后，在FESEM上樣進行觀察。

2 結果

2.1 M13耐藥性分析

本實驗對大腸桿菌M13、質控菌ATCC25922進行藥敏測試，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)美國臨床實驗室標準研究所出版的《藥敏實驗指南》的標準判定菌株對不同藥物的敏感性。如表2和圖1所示，大腸桿菌M13對12種抗生素表現(xiàn)出抗性R，其中四環(huán)素（TC）、阿莫西林/克拉維酸（AMC）、頭孢噻肟（CTX）、美羅培南（IPM）、呋喃妥因（FD）、甲氧芐啶/磺胺異惡唑（SXT）、洛美沙星（LOM）7種抗生素未發(fā)現(xiàn)抑菌圈，表明M13對這7種抗性很強，對慶大霉素（GM）、卡那霉素（K）、環(huán)丙沙星（CIP）、阿奇霉素（AZM）表現(xiàn)出敏感S。質控菌ATCC25922全為S，證明ATCC25922對所有抗生素敏感，進一步說明實驗的準確性。

表1 細菌耐藥性測試所選擇的16種抗生素

表2 大腸桿菌M13和ATCC25922的藥敏試驗

2.2 納米TiO2和四環(huán)素對大腸桿菌生長的影響

圖2中A和E表示四環(huán)素對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的生長的影響，對敏感菌ATCC25922的抑制作用相對較強；B和F表示TiO2-NPs對ATCC25922和M13的生長的影響，敏感菌ATCC25922在A3-A6濃度生長完全被抑制，而耐藥菌M13在M1-M3濃度下生長幾乎不受抑制，在M4-M6濃度下生長抑制作用在逐步增強；C和G表示不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs，結果表明敏感菌ATCC25922生長幾乎完全被抑制，而耐藥菌M13的生長在25 h后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象；D和H表示不同濃度的TiO2-NPs中加入0.5 mg/L的TC，結果與BF（TiO2-NPs單獨暴露）的生長曲線趨勢相近，說明在TiO2-NPs存在的前提下TC的加入對ATCC25922和M13作用并不明顯。圖CG與AE相比則可以看出，在TC存在的前提下TiO2-NPs的加入對敏感菌抑制作用增強，而對耐藥菌生長抑制變化不大。這些結果表明TiO2-NPs要比TC具有更強的細胞毒性，而且TiO2-NPs的加入增強了四環(huán)素對敏感菌ATCC25922的生長抑制作用。

圖1 大腸桿菌M13和ATCC25922藥敏試驗圖片

2.3 納米TiO2和四環(huán)素對菌株的抑菌率

圖3是TiO2-NPs和TC在單獨及共暴露條件下對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13抑菌率的影響。從圖3-A中可以看出TiO2-NPs單獨和聯(lián)合暴露下對其抑菌率在80%-100%之間，其中在不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs時，與單獨添加TC相比，其抑菌性出現(xiàn)了明顯的升高，而在不同濃度的TiO2中添加0.5 mg/L的TC時，其抑菌率達到了90%以上。從圖3-B可看出總體抑菌率在40%以下，單獨添加TiO2-NPs要比TC具有更強的抑菌性，不同濃度梯度的TC加入500 mg/L的TiO2-NPs與TC單獨暴露下箱線圖相似，其抑菌率都在40%以下且略高于TC。從整體上可以看出，TiO2-NPs和TC對耐藥菌M13的抑菌率要低于敏感菌，表明耐藥菌M13不僅對抗生素具有抗性，同時對納米TiO2也具有一定的抗性。

2.4 納米TiO2暴露對兩菌株的損傷作用

在模擬太陽光催化試驗研究光催化劑負載效應時發(fā)現(xiàn)，0.5 g/L的TiO2-NPs對大腸桿菌抑菌效率較高［25］。該結果與用太陽能反應器研究TiO2-NPs抑制懸浮的大腸桿菌結果一致［26］。故本實驗選取了500 mg/L的TiO2-NPs作為觀察對象，如圖4，結果發(fā)現(xiàn)敏感菌ATCC25922菌體損傷嚴重，不僅有穿孔，菌體的表面也出現(xiàn)了嚴重的破損。耐藥菌只出現(xiàn)了穿孔現(xiàn)象，再一次證明了TiO2-NPs對敏感菌的的傷害更強，而對于耐藥菌損傷程度則小很多，穿孔現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是TiO2-NPs顆粒產(chǎn)生的活性自由基對細胞壁和細胞膜的破壞，造成的菌體損傷。從表觀上可以看出耐藥菌M13對TiO2-NPs存在一定程度的耐受性。

3 討論

微生物產(chǎn)生耐藥的本質是細菌在抗菌藥物壓力下，受多種調(diào)控因子調(diào)控，多重耐藥機制并存的適應性機制［27］?？股啬退幮缘某霈F(xiàn)和擴散是不可避免的［28］。其耐藥機制主要有3種：外排泵、抗生素失活以及核糖體保護機制［29］。外排泵機制是細菌中耐藥性存在最多的一種耐藥機制，它是通過阻止抗生素在作用于自身靶細胞前排出抗生素，最終使細胞避免抗生素的傷害。在存在翻譯抑制性TC的情況下，細菌獲得抗性取決于AcrAB-TolC多藥外排泵，其能將少量的TC排出細胞外，讓細菌得以維持最低限度的蛋白合成功能，并且可以啟動TetA表達，進而菌株表現(xiàn)出TC抗性［30］。本實驗通過藥敏測試發(fā)現(xiàn)了耐藥菌對TC具有抗性，從生長曲線和抑菌率中發(fā)現(xiàn)，在所有選擇濃度的TC單獨暴露下，耐藥菌的生長幾乎不受抑制，外排泵可能是耐藥菌中四環(huán)素抗性的的主要調(diào)控因子。

圖2 TiO2-NPs和TC對大腸桿菌生長的影響

有研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2在較低濃度下就達到了抑菌效果［31］，與本實驗TiO2-NPs在低濃度下暴露的結果一致。TiO2-NPs在低于500 mg/L單獨暴露時，對敏感菌的抑菌率為54%-80%，高于500 mg/L暴露時，對敏感菌的抑菌率為92%-100%；而耐藥菌在其濃度低于500 mg/L時，對敏感菌的抑菌率在10%左右，高于500 mg/L時，對耐藥菌的抑菌率為20%-40%，實驗結果與張明等［32］的研究一致，說明TiO2-NPs對于耐藥菌和敏感菌都有生長抑制作用，對敏感菌作用更強。在TiO2-NPs高濃度暴露下，耐藥菌的抑菌率依然沒有達到60%以上，說明耐藥菌對TiO2-NPs也存在一定的抗性機制。從而可推測細菌的一些對抗生素的抗性機制，對TiO2-NPs也適用。

TC是具有多個可電離官能團的兩性分子，如三羰基甲烷、酚二酮和二甲氨基，這有助于增加它們與金屬氧化物的結合［33］。研究發(fā)現(xiàn)TC和TiO2-NPs不僅抑制微生物生長［34-35］，而且在共暴露時還發(fā)現(xiàn)了毒性增強效應［36］。同時在研究TC對TiO2-NPs在溶液里的行為時發(fā)現(xiàn)，TC吸附后導致TiO2-NPs的表面電荷增加，當TC濃度逐漸升高時，TiO2-NPs會發(fā)生聚集現(xiàn)象并逐漸增強［37］。由于TiO2-NPs存在尺寸效應，它的毒性隨粒徑變化而變化，較小的顆粒聚集之后會增加與細胞接觸的表面積，更有利于其在細胞上的附著并抑制細胞內(nèi)和細胞外物質運輸［19］，從而導致細胞代謝的中斷或死亡［20］，這些研究均說明TC和TiO2-NPs之間存在協(xié)同作用，會增強對微生物的毒性作用，與本研究結果一致。在本研究中兩者在共暴露情況下有增強其毒性的效應，如對菌株生長抑制作用增強。

微生物之間的基因水平轉移是微生物獲得耐藥基因的一種重要途徑，包括游離DNA和可移動元件的獲取。例如，質粒、轉座子、整合子、基因盒和噬菌體等［38］。換而言之，即使是非致病微生物的耐藥基因也可以作為致病微生物的生態(tài)基因庫［39］。最新研究發(fā)現(xiàn)，細菌之間在細胞膜被破壞后，通過質粒進行耐藥性的傳播，耐藥菌通過質粒將自身含有的抗性傳給敏感菌使其獲得耐藥性［30］。本研究對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的形貌觀察中均發(fā)現(xiàn)，在低劑量500 mg/L的TiO2-NPs濃度下，部分細胞出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象亦或是破損；也有部分細胞生長良好，表明TiO2-NPs對細胞壁和細胞膜具有一定的損傷作用，造成攜帶有耐藥的遺傳物質泄露，在一定程度上會促進耐藥性的傳播［40-41］。

圖3 TC和TiO2-NPs對大腸桿菌的抑菌率

圖4 TiO2-NPs對大腸桿菌菌體形態(tài)的影響

4 結論

本研究對雞糞中分離出的大腸桿菌M13和質控菌株（E.coliATCC25922）進行藥敏測試發(fā)現(xiàn)，M13具有12重抗性且包含TC抗性。與單獨添加梯度濃度四環(huán)素相比，納米TiO2的加入進一步抑制了敏感菌的生長，而耐藥菌變化不大。TiO2-NPs單獨和聯(lián)合暴露下對M13的抑菌率均在40%以下，而敏感菌在80%-100% 之間，耐藥菌M13除了耐抗生素，對納米TiO2也存在抗性，說明微生物對抗生素和其它環(huán)境毒性因子的抗性機制存在著一些共性。