張永麗 袁偉 楊清香
(河南師范大學生命科學學院,新鄉(xiāng) 453007)
目前抗生素污染導(dǎo)致嚴重的環(huán)境問題[1],包括生態(tài)風險和人類潛在的健康風險[2]。四環(huán)素(Tetracycline,TC)作為一大類被廣泛使用的抗生素,占總抗生素使用量的29%[3],并且在臨床上超過70%的四環(huán)素以活性形式被釋放到環(huán)境中[1]。美國在139條河流中有一半都檢測到了TC的存在[4],并且不同地點樣品中TC含量也有較大差別[5]。洪波等[6]用高效液相(HPLC-UV)技術(shù)測定水樣品中的四環(huán)素類、喹諾酮類等6種抗生素,檢測限(Limit of detection ,LOD)為 2.00-8.00 μg/kg。在不同環(huán)境樣品中的土霉素和四環(huán)素含量也有報道,其LOD分別為0.08和9 μg/kg[7],同時在食品樣品中TC檢出量為5-25 μg/kg[8],兩者遠遠低于微生物學抑菌實驗中 TC 的 LOD(25 μg/kg)[9],但在江蘇省的牛糞中TC檢出量達到了0.52 mg/kg[10]。孫剛等[11]研究結(jié)果表明,雞糞中土霉素含量高達11.25 mg/kg,超過了TC的平均含量(0.58 mg/kg)。根據(jù)歐盟的法規(guī),抗生素的環(huán)境濃度應(yīng)在10 μg/kg以下,目前對于四環(huán)素和四環(huán)素衍生物的評估濃度在450-900 μg/kg范圍內(nèi),比歐盟規(guī)定濃度高了約45-90倍[12]??股氐某?guī)定濃度的暴露造成了環(huán)境中微生物的耐藥性,而抗生素耐藥菌是否對其他環(huán)境暴露毒性因子(如納米材料)有抗性還知之甚少。
納米材料[13-14]作為新型污染物,其造成的污染已逐步成為嚴峻的環(huán)境問題[15],在土壤和水中均被檢出[16]。污水處理廠中產(chǎn)生的污泥、納米農(nóng)藥的應(yīng)用、納米誘導(dǎo)的土壤修復(fù)和擴散排放等都造成了土壤環(huán)境中納米材料的殘留[16];同時在市政污水中也檢測到了納米材料的存在[10]。納米材料的暴露會對微生物造成毒性,其中TiO2-NPs的抑菌原理研究較為清楚,TiO2-NPs經(jīng)光照接觸微生物,光照后在其表面產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(ROS)(如羥自由基,超氧根離子和過氧化氫),最終導(dǎo)致微生物的超氧化[17-18]。同時TiO2-NPs存在尺寸效應(yīng),它的毒性隨粒徑變化而變化,較小的顆粒會更容易聚集,從而導(dǎo)致與細胞接觸的表面積增加,更有利于其在細胞上的附著并抑制細胞內(nèi)和細胞外物質(zhì)運輸[19],甚至可能導(dǎo)致細胞代謝的中斷或死亡[20],這些研究表明TiO2-NPs對微生物存在很強的毒性。另一方面,環(huán)境中大腸桿菌比枯草芽孢桿菌對TiO2-NPs更敏感[21],表明大腸桿菌更容易受到TiO2-NPs的傷害。目前對于耐藥大腸桿菌的抗性機制研究,多數(shù)是從抗生素的種類和濃度著手,忽略了其他環(huán)境因子的影響。本研究以敏感菌和耐藥菌為實驗對象,探究了納米TiO2和四環(huán)素對大腸桿菌生長的影響。
菌種為從雞糞中分離出的大腸桿菌(M13),由本實驗室保存。質(zhì)控大腸桿菌ATCC25922購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。納米二氧化鈦,購自上海麥克林生化科技有限公司(Macklin Biochemical Co.Ltd),Bioscreen C(全自動生長曲線分析儀)來自芬蘭Bio-screen公司,F(xiàn)E-SEM(場發(fā)射掃描電鏡)型號為SIGMA500。
1.2.1 耐藥性測試 根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)手冊,選用了16種抗生素研究耐藥大腸桿菌的耐藥性,如表1所示。藥敏試驗采用紙片擴散法(藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司),將Escherichia coliATCC25922 作為對照菌株,大腸桿菌M13作為實驗菌株。實驗過程依據(jù)CLSI操作,菌液利用比濁管校正OD600=0.6,利用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑每個測3次,取平均值。
1.2.2 Bioscreen C測定生長曲線 TiO2-NPs配制的終濃度分別為125、250、500、1000、2000、4 000mg/L,命名為 Ti1、Ti2、Ti3、Ti4、Ti5、Ti6;TC 配制的濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/L,命名為TC1、TC2、TC3、TC4、TC5、TC6。 生 長 曲 線 的 測 定方法參照之前的研究[22],將質(zhì)控菌ATCC25922和M13分別接種到LB培養(yǎng)液中,接菌量為5%,總體系為250 μL,每個樣品3個平行。本實驗采用的是Bioscreen C,內(nèi)裝2塊微孔板共200個孔,每孔的容積為400 μL,在600 nm下進行測樣。其參數(shù)設(shè)定:37℃,150 r/min,40 h,每20 min測定一次OD值。
選取Bioscreen C測出的數(shù)據(jù),通過下式計算TiO2-NPs和TC對兩菌株的抑菌率[23]:
式中:Xs為抑菌率,A表示空白菌液吸光度值,B表示樣品菌液吸光度值。
1.2.3 FE-SEM實驗方法 按照場發(fā)射電鏡制備方法對樣品進行預(yù)處理,處理方法參照Jeon等[24]的研究,將質(zhì)控菌ATCCC25922和M13接種至LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)期。取菌液在3000 r/min離心3 min收集菌體,PBS清洗2-3次,加入4%的戊二醛靜置過夜,離心去上清,PBS清洗2-3次后進行乙醇梯度脫水,最后用適量的100% 叔丁醇懸浮菌體,樣品預(yù)處理之后,在FESEM上樣進行觀察。
本實驗對大腸桿菌M13、質(zhì)控菌ATCC25922進行藥敏測試,并用游標卡尺測量抑菌圈直徑,根據(jù)美國臨床實驗室標準研究所出版的《藥敏實驗指南》的標準判定菌株對不同藥物的敏感性。如表2和圖1所示,大腸桿菌M13對12種抗生素表現(xiàn)出抗性R,其中四環(huán)素(TC)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、頭孢噻肟(CTX)、美羅培南(IPM)、呋喃妥因(FD)、甲氧芐啶/磺胺異惡唑(SXT)、洛美沙星(LOM)7種抗生素未發(fā)現(xiàn)抑菌圈,表明M13對這7種抗性很強,對慶大霉素(GM)、卡那霉素(K)、環(huán)丙沙星(CIP)、阿奇霉素(AZM)表現(xiàn)出敏感S。質(zhì)控菌ATCC25922全為S,證明ATCC25922對所有抗生素敏感,進一步說明實驗的準確性。
表1 細菌耐藥性測試所選擇的16種抗生素
表2 大腸桿菌M13和ATCC25922的藥敏試驗
圖2中A和E表示四環(huán)素對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的生長的影響,對敏感菌ATCC25922的抑制作用相對較強;B和F表示TiO2-NPs對ATCC25922和M13的生長的影響,敏感菌ATCC25922在A3-A6濃度生長完全被抑制,而耐藥菌M13在M1-M3濃度下生長幾乎不受抑制,在M4-M6濃度下生長抑制作用在逐步增強;C和G表示不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs,結(jié)果表明敏感菌ATCC25922生長幾乎完全被抑制,而耐藥菌M13的生長在25 h后出現(xiàn)抑制現(xiàn)象;D和H表示不同濃度的TiO2-NPs中加入0.5 mg/L的TC,結(jié)果與BF(TiO2-NPs單獨暴露)的生長曲線趨勢相近,說明在TiO2-NPs存在的前提下TC的加入對ATCC25922和M13作用并不明顯。圖CG與AE相比則可以看出,在TC存在的前提下TiO2-NPs的加入對敏感菌抑制作用增強,而對耐藥菌生長抑制變化不大。這些結(jié)果表明TiO2-NPs要比TC具有更強的細胞毒性,而且TiO2-NPs的加入增強了四環(huán)素對敏感菌ATCC25922的生長抑制作用。
圖1 大腸桿菌M13和ATCC25922藥敏試驗圖片
圖3是TiO2-NPs和TC在單獨及共暴露條件下對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13抑菌率的影響。從圖3-A中可以看出TiO2-NPs單獨和聯(lián)合暴露下對其抑菌率在80%-100%之間,其中在不同濃度的TC中加入500 mg/L的TiO2-NPs時,與單獨添加TC相比,其抑菌性出現(xiàn)了明顯的升高,而在不同濃度的TiO2中添加0.5 mg/L的TC時,其抑菌率達到了90%以上。從圖3-B可看出總體抑菌率在40%以下,單獨添加TiO2-NPs要比TC具有更強的抑菌性,不同濃度梯度的TC加入500 mg/L的TiO2-NPs與TC單獨暴露下箱線圖相似,其抑菌率都在40%以下且略高于TC。從整體上可以看出,TiO2-NPs和TC對耐藥菌M13的抑菌率要低于敏感菌,表明耐藥菌M13不僅對抗生素具有抗性,同時對納米TiO2也具有一定的抗性。
在模擬太陽光催化試驗研究光催化劑負載效應(yīng)時發(fā)現(xiàn),0.5 g/L的TiO2-NPs對大腸桿菌抑菌效率較高[25]。該結(jié)果與用太陽能反應(yīng)器研究TiO2-NPs抑制懸浮的大腸桿菌結(jié)果一致[26]。故本實驗選取了500 mg/L的TiO2-NPs作為觀察對象,如圖4,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敏感菌ATCC25922菌體損傷嚴重,不僅有穿孔,菌體的表面也出現(xiàn)了嚴重的破損。耐藥菌只出現(xiàn)了穿孔現(xiàn)象,再一次證明了TiO2-NPs對敏感菌的的傷害更強,而對于耐藥菌損傷程度則小很多,穿孔現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是TiO2-NPs顆粒產(chǎn)生的活性自由基對細胞壁和細胞膜的破壞,造成的菌體損傷。從表觀上可以看出耐藥菌M13對TiO2-NPs存在一定程度的耐受性。
微生物產(chǎn)生耐藥的本質(zhì)是細菌在抗菌藥物壓力下,受多種調(diào)控因子調(diào)控,多重耐藥機制并存的適應(yīng)性機制[27]。抗生素耐藥性的出現(xiàn)和擴散是不可避免的[28]。其耐藥機制主要有3種:外排泵、抗生素失活以及核糖體保護機制[29]。外排泵機制是細菌中耐藥性存在最多的一種耐藥機制,它是通過阻止抗生素在作用于自身靶細胞前排出抗生素,最終使細胞避免抗生素的傷害。在存在翻譯抑制性TC的情況下,細菌獲得抗性取決于AcrAB-TolC多藥外排泵,其能將少量的TC排出細胞外,讓細菌得以維持最低限度的蛋白合成功能,并且可以啟動TetA表達,進而菌株表現(xiàn)出TC抗性[30]。本實驗通過藥敏測試發(fā)現(xiàn)了耐藥菌對TC具有抗性,從生長曲線和抑菌率中發(fā)現(xiàn),在所有選擇濃度的TC單獨暴露下,耐藥菌的生長幾乎不受抑制,外排泵可能是耐藥菌中四環(huán)素抗性的的主要調(diào)控因子。
圖2 TiO2-NPs和TC對大腸桿菌生長的影響
有研究發(fā)現(xiàn)納米TiO2在較低濃度下就達到了抑菌效果[31],與本實驗TiO2-NPs在低濃度下暴露的結(jié)果一致。TiO2-NPs在低于500 mg/L單獨暴露時,對敏感菌的抑菌率為54%-80%,高于500 mg/L暴露時,對敏感菌的抑菌率為92%-100%;而耐藥菌在其濃度低于500 mg/L時,對敏感菌的抑菌率在10%左右,高于500 mg/L時,對耐藥菌的抑菌率為20%-40%,實驗結(jié)果與張明等[32]的研究一致,說明TiO2-NPs對于耐藥菌和敏感菌都有生長抑制作用,對敏感菌作用更強。在TiO2-NPs高濃度暴露下,耐藥菌的抑菌率依然沒有達到60%以上,說明耐藥菌對TiO2-NPs也存在一定的抗性機制。從而可推測細菌的一些對抗生素的抗性機制,對TiO2-NPs也適用。
TC是具有多個可電離官能團的兩性分子,如三羰基甲烷、酚二酮和二甲氨基,這有助于增加它們與金屬氧化物的結(jié)合[33]。研究發(fā)現(xiàn)TC和TiO2-NPs不僅抑制微生物生長[34-35],而且在共暴露時還發(fā)現(xiàn)了毒性增強效應(yīng)[36]。同時在研究TC對TiO2-NPs在溶液里的行為時發(fā)現(xiàn),TC吸附后導(dǎo)致TiO2-NPs的表面電荷增加,當TC濃度逐漸升高時,TiO2-NPs會發(fā)生聚集現(xiàn)象并逐漸增強[37]。由于TiO2-NPs存在尺寸效應(yīng),它的毒性隨粒徑變化而變化,較小的顆粒聚集之后會增加與細胞接觸的表面積,更有利于其在細胞上的附著并抑制細胞內(nèi)和細胞外物質(zhì)運輸[19],從而導(dǎo)致細胞代謝的中斷或死亡[20],這些研究均說明TC和TiO2-NPs之間存在協(xié)同作用,會增強對微生物的毒性作用,與本研究結(jié)果一致。在本研究中兩者在共暴露情況下有增強其毒性的效應(yīng),如對菌株生長抑制作用增強。
微生物之間的基因水平轉(zhuǎn)移是微生物獲得耐藥基因的一種重要途徑,包括游離DNA和可移動元件的獲取。例如,質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、基因盒和噬菌體等[38]。換而言之,即使是非致病微生物的耐藥基因也可以作為致病微生物的生態(tài)基因庫[39]。最新研究發(fā)現(xiàn),細菌之間在細胞膜被破壞后,通過質(zhì)粒進行耐藥性的傳播,耐藥菌通過質(zhì)粒將自身含有的抗性傳給敏感菌使其獲得耐藥性[30]。本研究對敏感菌ATCC25922和耐藥菌M13的形貌觀察中均發(fā)現(xiàn),在低劑量500 mg/L的TiO2-NPs濃度下,部分細胞出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象亦或是破損;也有部分細胞生長良好,表明TiO2-NPs對細胞壁和細胞膜具有一定的損傷作用,造成攜帶有耐藥的遺傳物質(zhì)泄露,在一定程度上會促進耐藥性的傳播[40-41]。
圖3 TC和TiO2-NPs對大腸桿菌的抑菌率
圖4 TiO2-NPs對大腸桿菌菌體形態(tài)的影響
本研究對雞糞中分離出的大腸桿菌M13和質(zhì)控菌株(E.coliATCC25922)進行藥敏測試發(fā)現(xiàn),M13具有12重抗性且包含TC抗性。與單獨添加梯度濃度四環(huán)素相比,納米TiO2的加入進一步抑制了敏感菌的生長,而耐藥菌變化不大。TiO2-NPs單獨和聯(lián)合暴露下對M13的抑菌率均在40%以下,而敏感菌在80%-100% 之間,耐藥菌M13除了耐抗生素,對納米TiO2也存在抗性,說明微生物對抗生素和其它環(huán)境毒性因子的抗性機制存在著一些共性。