豆朋朋 王利 張樺 鄭姚

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigellode）屬于弧菌科鄰單胞菌屬，在魚類、哺乳動物及人類腸道中均有發(fā)現(xiàn)，主要引起人感染性腹瀉及食物中毒［1-3］。類志賀鄰單胞菌革蘭氏染色為陰性，是人類重要的腸炎性病原，可引起急性腸胃炎、腹瀉等癥狀，同時也可以引起敗血癥、腦膜炎、腹膜炎、蜂窩組織炎和肺炎等腸外感染癥狀［4-6］。類志賀鄰單胞菌在水環(huán)境中廣泛分布，被認(rèn)為是多種水產(chǎn)動物消化道炎癥的新病原，是一種世界性分布的細(xì)菌［7-13］。除了可以感染人類外，類志賀鄰單胞菌對水生動物也具有一定的致病性，如中華鱉、草魚和黃顙魚等都有被其感染而引起死亡的報道。其中，黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）是一種在我國各大水系干支流及附屬水體的江河、湖泊、池塘中廣泛分布的小型無鱗魚類，營養(yǎng)價值高，是目前大力發(fā)展的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖品種之一。近年來，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用越來越廣泛，雖然在疾病防控中發(fā)揮著重要作用，但是由于抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥情況及藥物殘留越來越嚴(yán)重，給人身體健康造成了一定的危害。目前，國內(nèi)沒有對從黃顙魚體內(nèi)分離的類志賀鄰單胞菌進(jìn)行耐藥表型及耐藥基因檢測的報道。本試驗對黃顙魚分離菌株L-1進(jìn)行了鑒定、耐藥表型與耐藥基因檢測，以期為該菌所致疾病的防治及耐藥機(jī)理的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 于四川省某水產(chǎn)市場發(fā)現(xiàn)一條黃顙魚，出現(xiàn)頭腹部及鰭部潰爛、出血、肝臟腫大以及出血等現(xiàn)象，體長15 cm，體重45 g。

1.1.2 主要試劑及儀器 Mueller-Hinton瓊脂、LB肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)；1.1×T3Super PCR MIX、4S Red Plus Nucleic Acid Stain、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)；DL2000 Marker，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-RAD USA公司生產(chǎn)；PCR儀，Eppendorf Germany公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察 用0.75%的無菌生理鹽水沖洗瀕臨死亡的黃顙魚，對其進(jìn)行剖檢，無菌采取黃顙魚的肝臟，于瓊脂平板上劃線，35℃恒溫培養(yǎng)20 h，挑取菌株L-1于平板劃線純化3次，挑取顏色、形狀相近的單菌落經(jīng)過3次液體LB肉湯培養(yǎng)基傳代后用50%的甘油保種備用。進(jìn)行革蘭氏染色鑒定：用草酸銨結(jié)晶紫初染、碘液媒染、95%乙醇脫色、番紅染色液復(fù)染，干燥后于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.2 生理生化鑒定 依據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》［14］中細(xì)菌鑒定的方法，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對待測菌株L-1進(jìn)行各項生化指標(biāo)的測定。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)設(shè)計類志賀鄰單胞菌 23S rRNA 基因特異性引物［15］；（aph（3'）-Ⅱa、ant（3''）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb和aac（3）-Ⅱa）4種氨基糖苷類抗生素耐藥基因引物［16］、（Sul1、Sul2和Sul3）3種磺胺類抗生素耐藥基因引物［17］、（TEM）1種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因引物［18］及16S rDNA基因的引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA試劑盒說明書提取菌株L-I及參考菌株糞腸球菌、嗜水氣單胞菌、沼澤紅假單胞菌、檸檬酸桿菌、乳酸片球菌總DNA，其濃度及質(zhì)量于紫外分光光度計檢測合格后（D260nm/D280nm=1.8-2.0），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 采用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2 min。以6種細(xì)菌總DNA為模板，以23S rRNA基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性2min；98℃變性 10 s，61℃退火 15 s，72℃延伸 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將菌株L-I的16S rDNA測序結(jié)果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫中核苷酸序列進(jìn)行BLAST比對，通過Neighbor-Joining方法，構(gòu)建菌株L-I系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用Mega 6.0軟件對以上序列進(jìn)行同源性分析。23S rRNA基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增條帶與目的片段是否一致。

1.2.6 人工感染試驗 于四川省成都市某水產(chǎn)市場購買健康黃顙魚50尾，體重在50±10 g范圍內(nèi)，在實驗室消毒后清洗干凈的魚缸內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨后隨機(jī)分為對照組和試驗組進(jìn)行試驗。將接種于LB肉湯培養(yǎng)基的菌種L-1放于35℃、110 r/min搖床培養(yǎng)20 h，隨后12000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌兩次，并制備成濃度為5×107CFU/mL的菌懸液。用無菌注射器抽取150 μL的菌懸液，對黃顙魚進(jìn)行腹腔注射，對照組注射等量的無菌生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，及時對死魚體內(nèi)的病原菌進(jìn)行分離鑒定。

1.2.7 藥敏試驗 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI/NCCLS）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。將保種的菌株L-1接種于滅菌生理鹽水中，并與麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^，將菌液濃度調(diào)整到0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取少量菌液均勻涂布魚MH瓊脂平板上，將藥敏片緊貼在平板表面，于35℃培養(yǎng)20 h后測定抑菌圈直徑。藥敏試驗采用的抗生素藥物有慶大霉素、哌拉西林、卡那霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、頭孢哌酮、頭孢曲松、苯唑西林、氨芐西林、頭孢他啶、羧芐西林、頭孢呋辛、頭孢唑林和克林霉素。

1.2.8 耐藥基因檢測 以菌株L-I總DNA為模板，以不同的耐藥基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，51-63℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察耐藥基因擴(kuò)增條帶與目的片段是否一致。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察

菌株L-1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h后，形成半透明較小菌落，表面光滑、濕潤。革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，菌株L-1被染為紅色，形態(tài)為短桿狀，單個或者成對排列，表明菌株L-I為革蘭氏陰性菌。

2.2 生理生化鑒定

分離菌株L-1的生理生化特征為氧化酶、硝酸鉀、半乳糖、色氨酸、精氨酸和葡萄糖反應(yīng)為陽性，V-P、硫化氫、七葉苷、甘露醇、明膠液化、檸檬酸和阿拉伯糖反應(yīng)為陰性。結(jié)果顯示，菌株L-1與類志賀鄰單胞菌具有相似的表型特征。

2.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

分離菌株L-1的16S rDNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1461 bp的片段，與預(yù)期相符（圖1）。將菌株L-1的16S rDNA基因正反測序序列拼接后提交至NCBI，獲得GenBank登錄號為MK348531。在NCBI中采用BLAST，對菌株L-I的16S rDNA基因序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。菌株L-I與NCBI中的類志賀鄰單胞菌BY160512菌株相似性為99%，與類志賀鄰單胞菌T2菌株相似性為98%。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株L-I與類志賀鄰單胞菌T2菌株位于同一分支（圖2）。應(yīng)用類志賀鄰單胞菌23S rRNA基因的特異性引物，對菌株L-I和參考菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅菌株L-I在280 bp左右存在目的條帶，參考菌株糞腸球菌、嗜水氣單胞菌、沼澤紅假單胞菌、檸檬酸桿菌和乳酸片球菌均未擴(kuò)增出（圖3），表明僅有L-I存在23S rRNA基因。因此，綜合形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定可判定菌株L-I為類志賀鄰單胞菌。

圖1 菌株L-1的16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 人工感染試驗

利用濃度為5×107CFU/mL的菌懸液和生理鹽水分別對試驗組和對照組各25尾黃顙魚進(jìn)行感染，試驗組有20尾黃顙魚出現(xiàn)頭腹部及鰭部潰爛、出血、肝臟腫大以及出血等現(xiàn)象，感染率為80%，死亡15尾，死亡率為60%；對照組黃顙魚未出現(xiàn)死亡及發(fā)病。

對患病的黃顙魚進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果表明所分離的致病菌同為類志賀鄰單胞菌。

2.5 藥敏試驗

K-B紙片法藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株L-1對β-內(nèi)酰胺類藥物中的頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、哌拉西林敏感，對苯唑西林、氨芐西林和羧芐西林耐藥；對氨基糖苷類藥物中的慶大霉素、卡那霉素敏感；對四環(huán)素類藥物中的米諾環(huán)素敏感，對四環(huán)素中度敏感；對林克胺類藥物中的克林霉素耐藥（表 1）。

圖2 菌株L-1系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 六種菌株的23S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.6 耐藥基因檢測

耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，菌株L-1擴(kuò)增出耐藥基因Sul2、TEM、ant（3''）-Ⅰa和aac（6'）-Ⅰb，大小約為790 bp、720 bp、280 bp和480 bp，與預(yù)期相符，耐藥基因aph（3'）-Ⅱa、aac（3）-Ⅱa、Sul1、Sul3均未檢出（圖4）。

表1 L-1菌株藥敏試驗結(jié)果

3 討論

類志賀鄰單胞菌是一種革蘭氏陰性、能運(yùn)動、兼性厭氧的細(xì)菌，該菌最先是從一位腸胃炎患者的糞便中分離出來。該菌也可感染赤麻鴨、犬，引起腸道疾病，導(dǎo)致死亡［19］。類志賀鄰單胞菌在我國許多種水產(chǎn)動物體中存在，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失的同時也給消費(fèi)者帶來了一定的健康安全隱患。

圖4 菌株L-1的Sul2、TEM、ant（3''）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

目前，鑒定類志賀鄰單胞菌主要依據(jù)16S rDNA基因PCR擴(kuò)增。張新艷等［20］利用類志賀鄰單胞菌23S rRNA基因特異性引物，對草魚體內(nèi)分離的類志賀鄰單胞菌和弧菌科水產(chǎn)常見病菌，如副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，只有類志賀鄰單胞菌在目的片段處有條帶，其余參考菌株均未擴(kuò)增出目的條帶。本試驗分別對菌株L-1的16S rDNA基因和23S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，16S rDNA基因PCR擴(kuò)增序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果與類志賀鄰單胞菌一致，只有菌株L-1的23S rRNA基因擴(kuò)增條帶與目的片段一致，參考菌株均未擴(kuò)增出。綜上可判斷菌株L-1為類志賀鄰單胞菌。

目前，關(guān)于類志賀鄰單胞菌對抗生素耐藥性的報道，如左躍等［21］從黃顙魚體內(nèi)分離的兩株類志賀鄰單胞菌對卡那霉素、氨芐西林等4種抗生素耐藥；楊星等［22］從患病大鯢體內(nèi)分離的類志賀鄰單胞菌對氨芐西林、苯唑西林等6種抗生素耐藥；張效平等［23］從江鱈體內(nèi)分離的類志賀鄰單胞菌對頭孢曲松、哌拉西林和慶大霉素等11種抗生素耐藥。本研究中黃顙魚分離菌株L-1對苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林耐藥等4種抗生素耐藥。這些結(jié)果顯示：β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性較普遍，這可能與β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣譜特性及大量使用有關(guān)；耐藥表型存在一定的差異，這可能與菌株來源不同，養(yǎng)殖場抗生素的使用情況有關(guān)。

在人類發(fā)現(xiàn)抗生素之前，耐藥性及耐藥基因在自然界存在數(shù)量非常少，但是抗生素的大量使用，加速了耐藥性的傳播。其中，耐藥基因在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移是耐藥性全球播散的最主要的遺傳基礎(chǔ)［24］。黃偉德等［25］廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌中ant（3''）-Ⅰ、Sul1和TEM耐藥基因檢出率分別為6.70%、43.30%和13.30%。廖成水等［26］雞源致病性沙門氏 菌 新 近 分 離 株 中Aph（3'）-Ⅱa、BlaTEM-1、Sul1、Sul2和Sul3檢出率分別為50.00%、28.57%、58.70%、41.30%和21.74%。賴海梅等［27］肉雞沙門氏菌中Sul1、Sul2和Sul3耐藥基因檢出率分別為43.48%、100.00%和60.87%。本試驗中，黃顙魚分離菌株 L-1中檢出Sul2、TEM、ant（3''）-Ⅰa、aac（6'）-Ⅰb耐藥基因。這些結(jié)果顯示：磺胺類耐藥基因、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因、氨基糖苷類耐藥基因檢出率較高，磺胺類耐藥基因檢出率最高，這可能與磺胺類藥物的大量使用有關(guān)；耐藥基因檢測結(jié)果存在一定差異，這可能是由于不同耐藥基因在不同細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移情況不同導(dǎo)致的。耐藥表型和耐藥基因的報道，如張楠馳等［28］在門多薩假單胞菌的藥敏試驗和耐藥基因檢測中，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因與相應(yīng)的耐藥表型一致，本試驗中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM與苯唑西林、氨芐西林和羧芐西林3種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥顯示其具有一致性。

4 結(jié)論

本試驗對黃顙魚分離菌株L-1進(jìn)行了鑒定、耐藥表型及耐藥基因檢測，確定該菌株為類志賀鄰單胞菌，該菌對黃顙魚具有較強(qiáng)的致病性，對苯唑西林、氨芐西林和克林霉素等耐藥，可以選用頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、哌拉西林、慶大霉素和卡那霉素等藥物進(jìn)行防治。但是由于細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性，在加強(qiáng)水質(zhì)管控和合理設(shè)置飼養(yǎng)密度，提高個體免疫力的同時，要定期輪換用藥，科學(xué)用藥。