郭璟 謝占玲 羅濤 薛治峰 郭建娟 李發(fā)雄 張秀娟

（青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院 青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

黃綠卷毛菇（Floccularia luteovirens）作為青藏高原高寒草原與草甸生態(tài)系統(tǒng)中最具有代表性的真菌之一［1］，不僅是名貴食藥用真菌，而且也是重要的高原生物資源［2］。青藏高原是黃綠卷毛菇最主要的發(fā)生地，黃綠卷毛菇主要生長(zhǎng)在矮嵩草草甸，高山嵩草、異針茅草原化草甸，嵩草雜草類(lèi)草甸，垂穗披堿草草甸［3］。對(duì)于黃綠卷毛菇菌絲體的培養(yǎng)，早期的研究發(fā)現(xiàn)黃綠卷毛菇菌絲對(duì)碳源的利用以紅糖為最佳，以酵母膏為最佳氮源，適宜的碳氮比為20-50∶1［4］。此后的研究結(jié)果顯示，該菌適宜碳源為蔗糖，氮源為蛋白胨，適宜的碳氮比為10∶1，最佳礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素是硫酸鎂［5］，最適pH為6.5，在暗處培養(yǎng)生長(zhǎng)最佳［6］。然而黃綠卷毛菇菌絲體的人工培養(yǎng)困難，產(chǎn)量低且菌絲體生物量發(fā)酵培養(yǎng)方面未見(jiàn)報(bào)道，人工種植目前尚未成功［7］。

內(nèi)生真菌廣泛存在植物的組織中，它與植物之間存在著復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制［8］，研究表明內(nèi)生真菌可以提高植物的分蘗數(shù)，增加植物的地上和地下的生物量［9］。矮嵩草、二柱頭藨草和高山嵩草是青藏高原高寒草甸中的建群種［10］。目前對(duì)青藏高原植物的內(nèi)生真菌研究比較少，張苗苗等［11］對(duì)甘肅省甘南州瑪曲草原的線(xiàn)葉嵩草進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離及其抗菌性質(zhì)的研究，分離到7株內(nèi)生真菌且部分具有抗菌活性。Zhang等［12］對(duì)祁連的3種灌木土壤的真菌多樣性進(jìn)行研究，采用培養(yǎng)和分子鑒定的方法對(duì)菌種進(jìn)行了鑒定。

本實(shí)驗(yàn)以黃綠卷毛菇生境中的矮嵩草為研究對(duì)象，采取黃綠卷毛菇0 cm、10 cm、20 cm及對(duì)照處的矮嵩草，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法與宏基因組測(cè)序法，研究黃綠卷毛菇生境中矮嵩草的內(nèi)生真菌多樣性，確定黃綠卷毛菇在植物中的內(nèi)生真菌的地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 矮嵩草樣品 本實(shí)驗(yàn)所用矮嵩草2018年8月采自青海省海北州海晏縣（海拔3200 m）高寒嵩草草甸。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200 g土豆，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1000 mL水。

1.2 方法

1.2.1 矮嵩草植物的處理與消毒 傳統(tǒng)法使用5株植物，植物葉子、基部、根各選取3份。其中葉子選取1 cm長(zhǎng)度，基部除去其包被鞘，根部選取1-1.5cm長(zhǎng)度。對(duì)選取的植物組織用自來(lái)水沖洗3次，蒸餾水漂洗3次，除去表面灰塵泥土。

宏基因組法選取距黃綠卷毛菇0 cm、10 cm、20 cm及對(duì)照處的矮嵩草，分為主根、側(cè)根、基部，樣品編號(hào)為：F-Z0、F-C0、F-J0、F-Z10、F-C10、F-J10、F-Z20、F-C20、F-J20、F-ZD、F-CD及 F-JD。植物組織同傳統(tǒng)法作相同處理。

植物組織用5.25%次氯酸鈉浸泡5 min，用無(wú)菌水漂洗4次以充分除去殘留的次氯酸鈉，再使用0.1%氯化汞浸泡植物組織5 min，最后用無(wú)菌水漂洗3次。

1.2.2 DNA提取 內(nèi)生真菌培養(yǎng)使用PDA培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)分離純化后采用CTAB法［13］提取DNA，使用ITS1和ITS4擴(kuò)增真菌的ITS序列［14］，送至上海生物工程有限公司測(cè)序。宏基因組法采用CTAB［13］法提取植物根總DNA，檢測(cè)合格的DNA樣品由上海生物工程有限公司進(jìn)行16S rRNA基因的V3-V4可變區(qū)擴(kuò)增并測(cè)序，采用 Illumina MiseqTM平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 對(duì)于測(cè)序結(jié)果使用的軟件有BioEdit、Sequencher、MEGA7， 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 使 用 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)。多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)計(jì)算采用柴新義等方法［15］。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法

2.1.1 內(nèi)生真菌的分離 傳統(tǒng)方法經(jīng)過(guò)分離鑒定得到66株內(nèi)生真菌，在真菌的分布上，基部（6.6）＞根（4.2）＞葉（2）（表1）。

表1 傳統(tǒng)法分離菌株的統(tǒng)計(jì)

2.1.2 內(nèi)生真菌菌群組成的多樣性分析 分離鑒定的66株菌均為子囊菌，分布于7目10屬，結(jié)果如表2所示，包括木霉屬（Trichoderma）、Stachybotriaceae、柱頂孢霉屬（Scytalidium）、鐮刀菌屬（Fusariumsp）、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）、微座孢屬（Microdochiumsp.）、青霉菌屬（Penicillium）、毛霉屬（Mucor）、鏈格孢屬（Alternaria alternata）、殼多孢屬（Stagonospora）。其中，殼多孢屬（Stagonospora）21株，占所分離菌株的31.82%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。

表2 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法66株內(nèi)生真菌分布情況

對(duì)傳統(tǒng)法培養(yǎng)的內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行分析見(jiàn)表3，根的多樣性指數(shù)（1.95）＞基部的多樣性指數(shù)（1.78）＞葉片的多樣性指數(shù)（1.17）。在豐富度指數(shù)上，基部的豐富度指數(shù)（1.95）＞根的豐富度指數(shù)（1.82）＞葉的豐富度指數(shù)（0.90）。根的均勻度指數(shù)（0.89）＞葉子的均勻度指數(shù)（0.84）＞基部的均勻度指數(shù)（0.74），表明矮嵩草中不同的組織中，內(nèi)生真菌的數(shù)量種類(lèi)是存在差異的。

傳統(tǒng)分離方法內(nèi)生真菌相對(duì)豐度結(jié)果見(jiàn)表4。主要分離到的是優(yōu)勢(shì)菌株：Stagonospora bicolor、Trichoderma rossicum、Colletotrichumsp.、uncultured fungus和Pleosporales sp.。在根組織中Stagonosporabicolor（7.58）和uncultured fungus的相對(duì)多度最高（7.58），基部中Stagonospora bicolor相對(duì)多度最高（24.24），葉子中Colletotrichumsp.的相對(duì)多度最高（7.58）。表明在矮嵩草植物中不同組織中的內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)菌株是不同的。

表3 傳統(tǒng)法內(nèi)生真菌菌群多樣性指數(shù)

表4 傳統(tǒng)方法內(nèi)生真菌相對(duì)豐度

2.1.3 內(nèi)生真菌菌群組成 采用鄰接法（Neighbor-Joining methods，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)如圖1，從進(jìn)化樹(shù)可以看出所有菌株可以分為3個(gè)分支，其中毛霉屬M(fèi)ucor和uncultured fungus MH30052分別占據(jù)2個(gè)分支，剩下的一支可以分類(lèi)到6個(gè)大類(lèi)。66株菌的NCBI登陸號(hào)為MH299988-MH300053。未分離到黃綠卷毛菇。

圖1 基于ITS基因部分序列構(gòu)建的部分菌株的Neighbour-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 宏基因組法

2.2.1 內(nèi)生真菌的分離 宏基因組法，12份樣品的OTU在屬的水平上展示如圖2，在各個(gè)樣品之間，屬的分布是不同的，占比最多的是Fusarium。

2.2.2 內(nèi)生真菌菌群組成的多樣性分析 基于宏基因組測(cè)序結(jié)果，其中12個(gè)樣品共分離鑒定到種水平的OTU數(shù)目為587，F(xiàn)usariumsp相對(duì)豐度是最高的，平均值為17.15；而在傳統(tǒng)分離的方法中，uncultured fungus和Stagonospora bicolor是相對(duì)多度最高，均為7.58（表5）。此外，雖然使用的是相同的組織樣品，對(duì)于多數(shù)的內(nèi)生真菌是比較難培養(yǎng)的，傳統(tǒng)法中分離的菌種占宏基因組的1.70%（10/587）。

圖2 屬水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布圖

宏基因組的結(jié)果分析顯示見(jiàn)表6，12份根的樣品中，不同樣品的多樣性指數(shù)，豐富度指數(shù)，均勻度指數(shù)是不同的。多樣性指數(shù)平均值為3.13、豐富度指數(shù)平均值為39.08、均勻度指數(shù)平均值為0.48。矮嵩草植物的不同組織中，多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)表現(xiàn)為：側(cè)根＞主根＞基部。

2.2.3 內(nèi)生真菌菌群組成 傳統(tǒng)分離方法所得到的全部菌株均分類(lèi)到子囊菌中，而宏基因組法分析豐度如圖3所示，其進(jìn)化組成關(guān)系中內(nèi)生真菌的組成中有子囊菌門(mén)（Ascomycota）占77.21%、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）占16.21%，剩下的6.58%為unclassified真菌，傳統(tǒng)法未分離到擔(dān)子菌的內(nèi)生真菌。表明在傳統(tǒng)分離真菌的過(guò)程中，子囊菌真菌是屬于易培養(yǎng)的真菌，而擔(dān)子菌真菌不易被培養(yǎng)。

2.3 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法與宏基因組法的比較

傳統(tǒng)法共分離到66株內(nèi)生真菌，均分類(lèi)到子囊菌門(mén)中，優(yōu)勢(shì)菌屬為殼多孢屬，而宏基因組法共檢測(cè)到587種內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌的組成中有子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)，且傳統(tǒng)多樣性指數(shù)（1.63）＜宏基因組法的均值（3.13），傳統(tǒng)法豐富度指數(shù)（1.56）＜宏基因組的均值（39.08），傳統(tǒng)法均勻度指數(shù)（0.82）＞宏基因組的均值（0.48），如表7所示。

3 討論

本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法并結(jié)合宏基因法，對(duì)青藏高原地區(qū)矮嵩草植物內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行了研究。傳統(tǒng)方法分離到66株內(nèi)生真菌，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于張苗苗等［11］對(duì)甘肅省甘南州瑪曲草原的線(xiàn)葉嵩草內(nèi)生真菌的分離，共分離到7株內(nèi)生真菌分別為鐮刀菌屬Fusarium、枝頂孢屬Acremoniumsp、黑團(tuán)孢霉屬Periconiasp。在本研究中也分離到了鐮孢屬，但并沒(méi)有分離到枝頂孢屬和黑團(tuán)孢霉屬這兩屬的內(nèi)生真菌。但在本研究中還分離出其它屬的內(nèi)生真菌，多樣性結(jié)果分析結(jié)果顯示，在矮嵩草植物中，根和基部的多樣性指數(shù)大于葉子的多樣性指數(shù)，基部和根的豐富度指數(shù)均大于葉片，表明矮嵩草的內(nèi)生真菌主要分布于基部和根，葉子分布較少，這可能與根際土壤微生物群落對(duì)植物體的作用有關(guān)［16］。

表5 宏基因組法內(nèi)生真菌相對(duì)豐度

表6 宏基因組法內(nèi)生真菌菌群多樣性指數(shù)

傳統(tǒng)培養(yǎng)與直接PCR法對(duì)菌根真菌的研究在其它植物中有相關(guān)的報(bào)道［17］，而宏基因組法對(duì)矮嵩草植物內(nèi)生真菌的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，12組根樣品共檢測(cè)到587種內(nèi)生真菌，而且內(nèi)生真菌的組成存在差異，表明不同個(gè)體的內(nèi)生真菌的組成可能存在差異。世界上大部分真菌在實(shí)驗(yàn)室很難培養(yǎng)出來(lái)［18］，傳統(tǒng)分離方法分離的菌株占宏基因組的1.70%（10/587），很大一部分的真菌并未被分離出來(lái)，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)技術(shù)只能培養(yǎng)很少一部分微生物，大部分微生物難以培養(yǎng)，純培養(yǎng)技術(shù)不能精確反映環(huán)境微生物的真實(shí)生存狀況［19］。研究?jī)?nèi)生真菌本身，傳統(tǒng)方法更為可靠具有后續(xù)研究的優(yōu)勢(shì)［20］，但面對(duì)未開(kāi)發(fā)的真菌，特別是擔(dān)子菌綱的真菌，很大的不足還是缺乏宿主系統(tǒng)［21］。利用宏基因組技術(shù)可以探明內(nèi)生真菌群落的組成［22］，且能夠更有效、更可靠地評(píng)估真菌的豐富度［23］。在對(duì)傳統(tǒng)與宏基因組的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)的比較分析上，傳統(tǒng)方法多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)是低于宏基因組法的均值，而在均勻度指數(shù)上傳統(tǒng)法大于宏基因組法，這樣的結(jié)果可能是由于真菌的對(duì)培養(yǎng)基的選擇，篩選出來(lái)的真菌是在PDA中的優(yōu)勢(shì)菌株和易培養(yǎng)菌株，這與Elizabeth等［24］所說(shuō)明的培養(yǎng)的方法低估了內(nèi)生真菌的多樣性相類(lèi)似，不同的方法存在著某種特殊的偏好性。而這些菌株的分布比較大，所以會(huì)造成指標(biāo)的偏離，不能真實(shí)的展示內(nèi)生真菌的多樣性和差異性。所以推測(cè)環(huán)境因素對(duì)植物內(nèi)生真菌的影響以及個(gè)體差異可能體現(xiàn)在那些非優(yōu)勢(shì)菌株中的變化上，而不是優(yōu)勢(shì)菌株。

圖3 GraPhlAn繪制的分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育信息可視化圖

表7 宏基因組法與傳統(tǒng)法的比較

通過(guò)兩種方法的比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法未分離到黃綠卷毛菇，而宏基因組法分離到相對(duì)豐度為11.39的黃綠卷毛菇，可能原因?yàn)辄S綠卷毛菇生長(zhǎng)緩慢，需要加富營(yíng)養(yǎng)，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)法用PDA平板培養(yǎng)，未能達(dá)到自然生境中的營(yíng)養(yǎng)要求。關(guān)于黃綠卷毛菇人工種植目前尚未成功，菌根類(lèi)型的研究及確定將是今后研究的方向。

4 結(jié)論

傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法共分離鑒定得到66株內(nèi)生真菌均為子囊菌門(mén)（Ascomycota），優(yōu)勢(shì)種群為Stagonospora bicolor；宏基因組法檢測(cè)到587種內(nèi)生真菌，子囊菌門(mén)占77.21%、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）占16.21%，剩下的6.58%為unclassified真菌，優(yōu)勢(shì)種群為Fusariumsp.。傳統(tǒng)法多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均小于宏基因組法，均勻度指數(shù)大于宏基因組法。黃綠卷毛菇生境的矮嵩草植物中，蘊(yùn)含著豐富的內(nèi)生真菌資源，黃綠卷毛菇為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌種群之一。