杜 歡，徐 僮，李 琪，王 張，張 靜?，范 剛?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都611137）

桃仁為常用中藥材，來源于薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子［1］，具有活血祛瘀、潤腸通便的功效，常用于治療閉經(jīng)、痛經(jīng)、跌打損傷、腸燥便秘等。光核桃仁為光核桃Amygdalus mira（Koehne）Yu et Lu.的干燥成熟種子［2］，藏文音譯為“康布”，產(chǎn)于西藏、四川、云南等地，常生于海拔2 000～4 000 m 的山坡雜木林中或山谷溝邊?，F(xiàn)代研究表明［3-6］，光核桃仁中含有苦杏仁苷、β-谷甾醇、反式角鯊烯、生育酚、維生素E、油酸、棕櫚酸等成分。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［7-8］光核桃仁具有一定的擴張血管及抗炎作用，且安全性良好。

光核桃仁曾收載于1987年版《四川省中藥材標(biāo)準》 增補本中［9］，而現(xiàn)行2010年版《四川省中藥材標(biāo)準》［10］與2015年版《中國藥典》 桃仁藥材項下并未收載光核桃仁Amygdalus mira。然而，據(jù)《常見中藥材品種整理與質(zhì)量研究》 中桃仁類專題研究結(jié)果［11］及本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藥材市場上存在有大量光核桃仁作為桃仁藥材流通和使用。目前，光核桃仁與桃仁樣品是否能等同使用仍然缺乏科學(xué)依據(jù)。因此，采用準確、客觀的方法研究桃仁與光核桃仁藥材的化學(xué)成分差異對于二者的品種鑒定及其能否等同使用評價具有重要的意義。

HPLC 指紋圖譜是從中藥多組分、多靶點出發(fā)的現(xiàn)代分析技術(shù)，現(xiàn)已成為國內(nèi)外中藥品種鑒定及質(zhì)量評控的常用方法［12-16］。目前，已有學(xué)者開展了桃仁藥材的指紋圖譜研究及質(zhì)量標(biāo)準研究［17-19］，但尚未見與光核桃仁藥材HPLC 指紋圖譜比較研究的文獻報道。本研究擬建立光核桃仁藥材HPLC 指紋圖譜，并結(jié)合偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）二者的化學(xué)成分差異，以期為2種桃仁的鑒定和區(qū)別提供參考依據(jù)，促進桃仁藥材的合理利用與開發(fā)。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配備二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器和柱溫箱（美國Agilent 公司）；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Sartorius BP121 s 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；ULUP-I-10T 優(yōu)普超純水機（成都超純科技有限公司）；CQ-250超聲波清洗器（上海必能信有限公司）；TDZ5-WS 臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。苦杏仁苷購自成都瑞芬斯生物科技有限公司（批號K-001-161216，含有量＞98%）。甲醇、乙醇均為分析純；乙腈、磷酸為色譜純；實驗用水為超純水。本研究共采集13批光核桃仁藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)王張副研究員鑒定為薔薇科植物光核桃Amygdalus mira（Koehne）Yu et Lu.的干燥成熟種子。此外，本研究收集了11批桃仁藥材，參考《常見中藥材品種整理與質(zhì)量研究》 中桃仁專項研究結(jié)果［11］，根據(jù)藥材性狀鑒定為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch（TR-2、TR-3和TR-5）或山桃Prunus davidiana（Carr.）Franch.（TR-1、TR-4、TR-6、TR-7、TR-8、TR-9、TR-10和TR-11）的干燥成熟種子。信息見表1。

表1 光核桃仁和桃仁樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Inertsil C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，程序（0～5 min，5%～8% B；5～20 min，8%～9% B；20～30 min，9%～15% B；30～40 min，15%～20% B；40～60 min，20%～27% B）；檢測波長210 nm；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加乙腈配制成0.120 mg／mL 的對照品溶液，作為參照物溶液，儲存在4 ℃的冰箱中，備用。

2.3 供試品溶液制備 取本品粗粉約2.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，加30%乙醇溶液20 mL，加熱回流30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用30%乙醇溶液補足減失質(zhì)量，搖勻，離心處理（4 000 r／min，10 min）。取上清液10 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批次（GHTR-12），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣5次，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于0.06%；共有峰相對峰面積RSD 小于2.6%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批次（GHTR-12），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12 h 進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于0.11%，共有峰相對峰面積RSD 小于2.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批次（GHTR-12）樣品5份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 小于1.1%，共有峰相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 HPLC 指紋圖譜建立及分析

2.5.1 HPLC 指紋圖譜建立 取不同批次的光核桃仁及桃仁藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣。13批光核桃仁藥材HPLC 指紋圖譜中有12個共有峰。由于苦杏仁苷在各批次光核桃仁中均有出現(xiàn)，分離度良好，且峰面積較大，故選擇苦杏仁苷（9號峰）作為參照峰。見圖1。

圖1 光核桃仁與桃仁HPLC 指紋圖譜

2.5.2 相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”系統(tǒng)評價軟件，分別導(dǎo)入13批光核桃仁、11批桃仁樣品指紋圖譜的AIA 數(shù)據(jù)文件，設(shè)置多點校正，采用中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為1.0，自動匹配，生成對照指紋圖譜，以特征指紋圖譜共有模式為對照，計算各批次樣品的相似度。結(jié)果，光核桃仁各批次樣品的相似度為0.922～0.996；桃仁各批次樣品的相似度為0.904～0.997，見表2。

表2 各樣品相似度

2.5.3 HPLC 指紋圖譜比較 通過直觀比較，發(fā)現(xiàn)光核桃仁與桃仁樣品HPLC 指紋圖譜大體相似，二者均具有12個共有峰，但部分化學(xué)成分的峰面積存在較大的差異，如共有峰9、10、11和12，其中11號與12號峰差異最為明顯。

2.5.3.1 偏最小二乘法判別分析 為了研究光核桃仁與桃仁樣品的化學(xué)成分差異，將二者12個共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 軟件進行偏最小二乘法判別分析（PLSDA），根據(jù)PLS-DA 得分圖和載荷圖觀察2個品種的區(qū)別，并找出引起差異的主要成分。先采用中心化方法對原始峰面積數(shù)據(jù)進行尺度同一化處理，再進行PLS-DA 分析。結(jié)果PLS-DA 模型參數(shù)為R2X=80.4%、R2Y=87.5%，Q2=70.0%，可見模型擬合良好。圖2表明，PLS-DA 模型能夠很好的區(qū)分光核桃仁與桃仁樣品，同時也表明2種桃仁樣品的化學(xué)成分具有明顯差異。此外，根據(jù)載荷圖，見圖3，可知，9、11、12號峰為引起差異的最主要化學(xué)成分，對分類的影響最大，其中9號峰根據(jù)對照品對照鑒定為D-苦杏仁苷。

圖2 桃仁與光核桃仁樣品PLS-DA 得分圖

圖3 桃仁與光核桃仁樣品PLS-DA 載荷圖

2.5.3.2 差異成分顯著性分析 利用PLS-DA 多變量分析方法，能夠從多維數(shù)據(jù)中尋找出貢獻于分類的主要差異成分。然而，并不能判斷觀察到的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，有必要采用統(tǒng)計分析方法進一步確證差異的顯著性。本研究采用SPSS 21.0分析軟件對PLS-DA 分析發(fā)現(xiàn)的差異成分（9、11、12號峰）進行t檢驗。結(jié)果9號峰（P=0.02＜0.05）、11號峰（P=0.00＜0.01）和12號峰（P=0.00＜0.01）在2種桃仁藥材之間均具有顯著性差異，其中9號峰為D-苦杏仁苷。

3 討論

3.1 樣品制備方法的優(yōu)化 本研究分別對樣品提取方法、溶劑等進行考察，采用冷浸、超聲和回流提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷浸提取的效率最低，而超聲提取的效率最高。然而，由于光核桃仁與桃仁樣品中均存在苷類成分酶解的情況［17］，如果采用超聲提取的方式，會導(dǎo)致藥材中化學(xué)成分發(fā)生改變。課題組在預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)光核桃仁的10、11、12號峰均不穩(wěn)定，其峰面積會不斷變化，影響指紋圖譜的建立。因此，本研究最終選擇回流提取方法，以高溫破壞酶的活性，殺酶保苷。此外，本研究還考察了提取溶劑，包括石油醚、乙酸乙酯、不同濃度的甲醇、乙醇和水，最終發(fā)現(xiàn)30%乙醇的提取效果最佳。

3.2 色譜條件優(yōu)化 本研究比較了Inertsil C18柱、InertSustain C18柱及WondaSil C18柱的分離效果，結(jié)果以Inertsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱的分離效果最佳；考察樣品在210、254、280 nm 等不同波長下的吸收情況，結(jié)果以210 nm 波長處吸收最佳；考察了3個不同柱溫條件（20、25、30 ℃），發(fā)現(xiàn)樣品的色譜圖基本類似，無較大區(qū)別，故柱溫選擇出峰時間適中的25 ℃。此外，考察了甲醇-純水、甲醇-0.2% 磷酸、乙腈-純水、乙腈-0.2% 磷酸等不同流動相對化學(xué)成分分離效果的影響，最終選擇乙腈-0.2%磷酸為流動相。

3.3 結(jié)果分析 本研究首次建立了光核桃仁HPLC 指紋圖譜，指定了12個共有峰。根據(jù)云琦等［17］的研究報道，苦杏仁苷存在旋光異構(gòu)，在桃仁藥材中常存在L-苦杏仁苷和D-苦杏仁苷2種構(gòu)型。根據(jù)對照品對照結(jié)果及文獻報道，光核桃仁HPLC 指紋圖譜中8號峰鑒定為L-苦杏仁苷，9號峰鑒定為D-苦杏仁苷。其中，D-苦杏仁苷在藥材中的含有量較高，L-苦杏仁苷含有量較低。此外，根據(jù)相關(guān)文獻報道［3-4］，課題組對光核桃仁藥材中是否含有β-谷甾醇、生育酚和維生素E 進行研究，結(jié)果僅測定出β-谷甾醇，但含有量很低，故未作為共有峰，而生育酚和維生素E 并未檢測出。

3.4 比較分析 本研究所建立的HPLC 指紋圖譜及PLSDA 分析方法，能夠很好的區(qū)分光核桃仁與桃仁，為市場上2種桃仁藥材的鑒別提供了參考方法。HPLC 指紋圖譜比較可知，光核桃仁與桃仁樣品的化學(xué)成分大體相似，均具有12個共有峰，表明2種桃仁藥材在市場上混合使用有一定的依據(jù)。然而，根據(jù)PLS-DA 及t檢驗分析結(jié)果，可知2種桃仁藥材中的3種化學(xué)成分（9、11、12號峰）含有量有明顯差異。因此，光核桃仁作為桃仁藥材使用仍需慎重，這3種成分的含有量差異是否會導(dǎo)致藥材的有效性和安全性不同，值得進一步研究。此外，經(jīng)過對照品對照，HPLC指紋圖譜中9號峰鑒定為D-苦杏仁苷，但11、12號峰目前無法指認，課題組下一步將采用GC-MS、HPLC-MS 等技術(shù)進一步鑒定這2種差異成分。