趙 琪，賈昌平，錢葉飛，陳麗波

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州215104）

保健食品是指一類具有特定保健功能的食品，供特定人群使用以調(diào)節(jié)機(jī)體，卻不能以治療疾病為目的［1］。緩解體力疲勞類保健食品中非法添加藥物最常見的是PDE-5抑制劑［2-3］，而近年來新的添加成分層出不窮，一些不法商販為了牟取暴利，在這類產(chǎn)品中添加化學(xué)藥品甚至是合成中間產(chǎn)物［4-5］，從而提高產(chǎn)品的療效，謀求暴利。這類非法添加的化學(xué)物質(zhì)若長期使用，非但起不到強(qiáng)身健體的效果，甚至?xí)p害人體健康［6］。

國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中涉及11種PDE-5選擇性抑制劑［7］，為規(guī)避檢查，不法生產(chǎn)者采取添加標(biāo)準(zhǔn)外的物質(zhì)［8］，除西地那非的其他類似物之外，課題組在緩解體力疲勞類保健食品中首次檢出對(duì)乙酰氨基酚以及西地那非雜質(zhì)12。對(duì)乙酰氨基酚是一類非甾體類抗炎藥，在臨床上用于抗炎鎮(zhèn)痛類化學(xué)藥品中［9］，且大劑量使用會(huì)存在一定的不良反應(yīng)［10］。

目前，在緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學(xué)藥物的檢測中，液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法（HPLC-MS／MS法和UPLC-MS／MS 法）的應(yīng)用較多［11-14］，但由于違禁成分添加量通常較大，容易導(dǎo)致質(zhì)譜污染，檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性；以及原國標(biāo)方法中的HPLC 法出峰慢、時(shí)間長、不利于快速定性、定量［15］。因此需建立一種高效檢測方法。本研究參考國家食品藥品監(jiān)督管理局文件中規(guī)定的11種那非類化藥的檢測方法，使用UPLC 進(jìn)行快速定性、定量。并做了方法學(xué)考察，最后使用該方法進(jìn)行多批樣品檢測，以期實(shí)現(xiàn)此類非法添加化學(xué)藥物的快速篩查，為進(jìn)一步的質(zhì)譜確證提供有力的保障。

1 材料

1.1 儀器 KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Synergy system 型超 純水儀（美國Millipore 公司）；TZL-5009型可調(diào)速漩渦混勻器；Heraeusbiofuge primor 型高速離心機(jī)（美國Thermo 公司）；Waters ACQuity UPLC 超高效液相色譜儀，配有2998型二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）。

1.2 試藥 實(shí)測樣品來自蘇州市食品藥品監(jiān)督管理局抽檢樣品。

對(duì)照品鹽酸育亨賓（批號(hào)Y100800，含有量100%）購于（TRC 加拿大化工公司）；那紅地那非（批號(hào)1591-080A3，含有量99.2%）、紅地那非（批號(hào)1218-018A12，含有量99.1%）、伐地那非（批號(hào)1132-035A1，含有量99.5%）、豪莫西地那非（批 號(hào)1220-030A3，含有量98.7%）、氨基他達(dá)拉非（批 號(hào)1638-004A2，含有量99.9%）、他達(dá)拉非（批號(hào)1156-051A1，含有量99.7%）、硫代艾地那非（批號(hào)1214-006A3，含有量99.5%）、偽伐地那非（批號(hào)1217-011A2，含有量99.5%）、那莫西地那非（批號(hào)1320-054A2，含有量99.9%）、西地那非雜質(zhì)12（批號(hào)2478-038A2，含有量99.1%）均購于（加拿大TLC Pharmachem 公司）；西地那非（批號(hào)510068-201401，含有量100.0%）、對(duì)乙酰氨基酚（批號(hào)100018-201610，含有量100%）均購于中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈和乙酸均為色譜純，其他試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Luna UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-乙腈（B）-磷酸三乙胺溶液（C），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.3 mL／min；檢測波長200～400 nm；柱溫30 ℃；樣品室溫度室溫；進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液

2.2.1.1 對(duì)照品貯備液 精密稱取那紅地那非及其相應(yīng)的對(duì)照品約5 mg，置10 mL 量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度約為0.5 mg／mL 的對(duì)照品貯備液，于-20 ℃冰箱中保存。

2.2.1.2 混合對(duì)照品溶液 取“2.2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液（0.5 mg／mL）各100 μL 于5 mL 量瓶中，加乙腈定容至5 mL，混勻，即得13種對(duì)照品混合溶液。

2.2.1.3 檢出限溶液配制 取混合對(duì)照品溶液100 μL，置于5 mL 量瓶中，用磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（60 ∶20 ∶20）溶液定容至5 mL，作為檢出限溶液。

2.2.2 供試品溶液 取1次口服量樣品，研磨研細(xì)后，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于1次服用量），置10 mL 量瓶中，加乙腈至10 mL，超聲20 min，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，于14 000 r／min 離心5 min，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 空白樣品溶液 不加樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備空白樣品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各適量，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣0.5 μL。記錄色譜圖和各物質(zhì)的紫外吸收光譜圖見圖1～2，從色譜圖中可以看出13種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均達(dá)到基線分離。

圖1 各物質(zhì)UPLC 色譜圖（230 nm）

2.4 線性關(guān)系考察 將上述“2.2.1”中配制好的混合對(duì)照品貯備液逐級(jí)稀釋 成2.5、5.0、10.0、25.0 μg／mL、50.0 μg／mL，將系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性擬合，從而得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。13種化合物的線性范圍為2.5～50.0 μg／mL。相關(guān)系數(shù)均在0.9990及以上，各分析物在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

2.5 定量、檢測限 分別精密量取“3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用陰性樣品溶液等倍逐步稀釋，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣1 μL，記錄峰高。當(dāng)信噪比為10 ∶1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶1時(shí)，得檢測限，見表2。

表2 各對(duì)照品線性關(guān)系及檢出、定量限

2.6 精密度試驗(yàn) 將混合對(duì)照品溶液在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各物質(zhì)色譜峰面積RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

圖2 各對(duì)照品紫外吸收光譜圖（230 nm）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為50.0 μg／mL 的混合對(duì)照品溶液及供試品溶液（MAXMAN coffee），于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄峰面積，他達(dá)拉非峰面積的RSD 值小于2.0%。表明對(duì)照品溶液及供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（MAXMAN coffee）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得他達(dá)拉非峰面積RSD小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 以不含非法添加化學(xué)物質(zhì)的緩解體力疲勞類保健食品為基質(zhì)，在1個(gè)添加水平進(jìn)行回收率測定，使回收率溶液最終質(zhì)量濃度為2.5 μg／mL，平行制備6份，進(jìn)樣，分析。得13種物質(zhì)的平均加樣回收率在94.68%～115.30%之間，RSD 小于6%。

2.10 樣品含有量測定 按“3.2”項(xiàng)下方法處理樣品，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測定。本實(shí)驗(yàn)選擇了市售及查獲的緩解體力疲勞類保健食品進(jìn)行檢測，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合保留時(shí)間及其光譜圖對(duì)樣品進(jìn)行篩查，并通過外標(biāo)法對(duì)檢出的化學(xué)成分定量。結(jié)果表明，4批檢出西地那非，1批檢出他達(dá)拉非，1批檢出氨基他達(dá)拉非，2批檢出西地那非雜質(zhì)12，2批檢出對(duì)乙酰氨基酚，3批未檢出，陽性樣品均已通過UPLC-MS／MS 確證。見表3、圖3。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 原國標(biāo)方法中甲醇-乙腈-0.7% 三乙胺水溶液20 ∶20 ∶60（磷酸調(diào)pH 至2.0），出峰快，那非類物質(zhì)分離效果不佳。通過降低初始有機(jī)相比例，提高水相比例，將13種物質(zhì)尤其是那非類出峰延后，達(dá)到了較好的分離效果。此外，水相添加劑的選擇考察了甲酸、乙酸，二者對(duì)于那非類分離效果不如0.7%三乙胺水溶液的洗脫性好，故水相仍沿用國標(biāo)中0.7%三乙胺水溶液。

表3 樣品信息及測定結(jié)果

圖3 MAXMAN coffee UPLC 色譜圖（230 nm）

其次，色譜柱柱溫的高低會(huì)對(duì)緩解體力疲勞類非法添加化學(xué)物質(zhì)的分離效能和分析速度產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)分別考察柱溫20、25、30、35、40 ℃的分離情況，20、25 ℃柱溫接近室溫，受室溫影響，溫度有可能會(huì)有波動(dòng)，對(duì)分離效果改善也不理想；35、40 ℃對(duì)那非類的分離并沒有起到正向的作用，故最終確定柱溫30 ℃。

選擇了粒徑、長度相似的常規(guī)C18色譜柱，分別是Waters UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、LUNA UPLC C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）以及Agilent ZORBAX Eclipse plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。其中LUNA UPLC C18柱相較前兩者來說，在同樣的流動(dòng)相比例及相同柱溫條件下，對(duì)于那非類化合物分離效果更好。

3.2 優(yōu)勢和不足 本實(shí)驗(yàn)所建立的方法適用于緩解體力疲勞類保健食品中非法添加化學(xué)物質(zhì)的初步篩查，對(duì)陽性的結(jié)果還需進(jìn)行質(zhì)譜確證。由于質(zhì)譜儀靈敏度高，在樣品前處理中容易導(dǎo)致交叉污染，故在實(shí)際檢驗(yàn)工作中需要利用靈敏度較低的紫外檢測器做初步判別。本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-DAD 法可滿足保健食品的初篩及定量要求，較質(zhì)譜法更利于推廣。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)實(shí)際檢測工作的需要以及前期實(shí)驗(yàn)的積累，建立了一種快速篩查方法。涉及13種化學(xué)物質(zhì)并具有一定的代表性。優(yōu)化后的方法較原國標(biāo)方法在時(shí)間上縮短至20 min，大大提高了檢測效率、降低了檢出限、提高了靈敏度、減少假陽性的風(fēng)險(xiǎn)；其次，出峰快體積流量小、節(jié)省流動(dòng)相，更環(huán)保。該方法適用于保健食品中非法添加藥物的初步篩查及陽性藥物的定量檢測，已用于日常檢驗(yàn)工作中，尤其在承接公安辦案類應(yīng)急檢測中，縮短檢測時(shí)間，有力的提升了檢驗(yàn)效率。