卞振華，胡敏敏，袁曉航，劉 順，費(fèi)逸明?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫214000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210000）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱北五味子，分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、寧夏、甘肅、山東等地。其味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效。臨床常用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴以及心悸失眠等疾?。?-6］。本課題組前期研究表明，70%乙醇提取的五味子依次經(jīng)石油醚（60～90 ℃）、三氯甲烷和乙酸乙酯分段萃取，乙酸乙酯萃取組分經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂分離水洗脫，得到抗MRSA 體外抑菌活性組分（EEW），同時對抗生素敏感金黃色葡萄球菌和臨床分離的耐藥MRSA 均具有較強(qiáng)的抑菌活性［7］。本實(shí)驗(yàn)采用偏最小二乘回歸分析法，對五味子抗MRSA 體外抑菌活性組分的UPLC-MS 特征指紋圖譜與體外抑菌活性藥效進(jìn)行相關(guān)性分析，以期篩選出五味子抗MRSA 主要抑菌活性成分（群），初步揭示五味子抑菌活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥 五味子（9批藥材產(chǎn)地及采收時間見表1）經(jīng)無錫市中醫(yī)醫(yī)院胡敏敏副主任中藥師鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，標(biāo)本（編號YXB20161101～YXB20161109）保存于中藥研究室；萬古霉素（西班牙Lilly 公司，批號C752996）；檸檬酸（中國食品藥品檢定研究院，批號111679-201602）。

表1 樣品信息

乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；甲酸（色譜純，美 國Sigma-Aldrich 公 司）；水（超純水，美 國Millipore 公司）；AB-8大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；其他試劑均為分析純。MH 瓊脂培養(yǎng)基（批號3105584，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；MH 肉湯培養(yǎng)基（批號3105299，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 43300（批號20160510，廣東省微生物菌種保藏中心）。

1.2 儀器 Acquity UPLC 超高效液相色譜儀、Maldi synapt QTOF-MS 四級桿飛行時間質(zhì)譜（英國Waters 公司）；SHP-100型生化培養(yǎng)箱（常州普天儀器制造有限公司）；BSC-1300型生物安全柜（上海上凈凈化設(shè)備有限公司）；WGZ-2XJ 型細(xì)菌濁度儀（北京鑫骉騰達(dá)儀器設(shè)備有限公司）；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；BSA224SCW 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 五味子抗MRSA 體外抑菌活性組分制備 稱取經(jīng)65 ℃干燥后粉碎的五味子藥材10 g，料液比為1 ∶10加入70%乙醇回流提取3 h，80 ℃提取2次，合并2次提取液，旋蒸濃縮至干，得五味子乙醇提取物浸膏。加純化水100 mL 混懸，分別依次用等體積石油醚（60～90 ℃）、氯仿、乙酸乙酯各萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮至干得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物混懸于純化水中，配制成10 g／L 的上樣液，上預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，大孔樹脂用量60 g，料液比3 ∶1，上樣體積流量2 mL／min，靜置吸附3 h，用3倍柱體積的純化水洗脫，洗脫體積流量4 mL／min。收集純化水洗脫組分，濃縮至干，真空干燥得到AB-8大孔吸附樹脂分離五味子乙酸乙酯萃取物純化水洗脫組分（抗MRSA 體外抑菌活性組分）。

2.2 抗MRSA 活性組分抑菌藥效測定

2.2.1 菌懸液制備 選取耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 43300單個典型菌落于MH 肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，用濁度儀校正菌懸液至0.1麥?zhǔn)媳葷釂挝?，含菌量?×107CFU／mL 備用［8］。

2.2.2 抗MRSA 體外抑菌活性藥效學(xué)測定 按2015年版《中國藥典》 推薦的管碟法測定體外抑菌活性，取直徑90 mm 培養(yǎng)皿，加入融化的MH 瓊脂培養(yǎng)基20 mL，均勻攤布，放置冷卻凝固，作為底層。另取MH 瓊脂培養(yǎng)基加熱融化后冷卻至50 ℃，加入“2.2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)菌懸液，使含菌量為1.0%，搖勻后加5 mL 至培養(yǎng)皿中，在底層上均勻攤布，作為菌層。放置冷卻凝固后，在菌層上等距離均勻放置不銹鋼小管［內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm］4個［9］。取9批五味子藥材，按“2.1”項(xiàng)下方法制備9批五味子抗MRSA 體外抑菌活性組分供試品，精密稱取，加無菌水配制成100 g／L 供試品溶液。向每個不銹鋼小管加入0.1 mL 供試品溶液。每個供試品溶液測試單獨(dú)重復(fù)3次，培養(yǎng)皿置于生化培養(yǎng)箱37 ℃下培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，測出9批五味子抗MRSA 體外抑菌活性組分供試品溶液抑菌圈直徑平均值。分別在各皿中加入萬古霉素陽性對照組，向不銹鋼小管中加入質(zhì)量濃度為10 g／L 的萬古霉素0.1 mL。設(shè)陰性對照組，向不銹鋼小管中加0.1 mL 的無菌水溶液。根據(jù)抑菌系數(shù)判斷各組分對細(xì)菌的敏感性，抑菌系數(shù)越大表明抑菌活性越強(qiáng)［10］。

2.3 UPLC-MS 特征指紋圖譜建立

2.3.1 供試品溶液制備 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，精密稱取0.005 0 g，2 mL 甲醇溶解，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.3.2 色譜條件 色譜柱Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，洗脫程序（0～3 min，0%A；3～10 min，0%～15%A；10～12 min，15%～80% A；12～12.1 min，80%～0%A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.3.3 質(zhì)譜條件 電噴霧電離離子源（ESI），負(fù)離子模式掃描質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流量50 L／h，脫溶劑氣流量700 L／h。低能量掃描傳輸碰撞能量6 eV，高能量掃描傳輸碰撞能量20 eV，掃描質(zhì)量范圍為m／z20～1 000。

3 結(jié)果

3.1 抗MRSA 體外抑菌活性組分收率 按“2.1”項(xiàng)下方法制備9批五味子藥材乙酸乙酯萃取物分別為0.291 2、0.321 5、0.334 5、0.323 5、0.345 7、0.326 7、0.341 2、0.308 9、0.324 3 g，收率分別為 2.912%、3.215%、3.345%、3.235%、3.457%、3.267%、3.412%、3.089%、3.243%。9批五味子藥材抗MRSA 體外抑菌活性組分分別為0.197 3、0.200 7、0.223 4、0.228 3、0.232 4、0.228 9、0.232 3、0.208 7、0.213 4 g，收率分別為1.973%、2.007%、2.234%、2.283%、2.324%、2.289%、2.323%、2.087%、2.134%。

3.2 抗MRSA 活性部位抑菌活性檢測結(jié)果 根據(jù)抑菌系數(shù)（抑菌系數(shù)=供試液的抑菌圈直徑／同一培養(yǎng)皿中萬古霉素的抑菌圈直徑），判斷各批次組分對MRSA 的敏感性。見表2，與陰性對照組（抑菌圈直徑為7.80 mm，即沒有產(chǎn)生抑菌作用）相比，9批五味子抗MRSA 體外抑菌活性組分均具有一定的抗MRSA 活性，都有極顯著性差異（P＜0.01），其中S2的抗MRSA 抑菌活性最強(qiáng)。

表2 9批樣品抗MRSA 體外抑菌活性組分抗MRSA 抑菌活性（， n=3）

表2 9批樣品抗MRSA 體外抑菌活性組分抗MRSA 抑菌活性（， n=3）

注：與陰性對照組比較，??P＜0.01

3.3 UPLC-MS 特征指紋圖譜分析 對9批五味子抗MRSA體外抑菌活性組分運(yùn)用MassLynx V4.1對負(fù)離子模式總離子流圖分析處理，UPLC-MS 特征指紋圖譜見圖1。運(yùn)用Integrate chromatogram 軟件自動積分，分別導(dǎo)出特征圖譜中的各峰面積，根據(jù)各樣品特征指紋圖譜的各峰保留時間，共匹配出11個共有峰，見表3。

圖1 9批樣品抗MRSA 體外抑菌活性組分UPLC-MS 特征指紋圖譜

表3 不同產(chǎn)地樣品抗MRSA 體外抑菌活性組分共有峰峰面積

3.4 譜效關(guān)系分析

3.4.1 偏最小二乘回歸方程建立 以特征指紋圖譜中代表化學(xué)成分各峰的峰面積為自變量X，五味子抗MRSA 活性部位的抑菌系數(shù)為因變量Y，采用SIMCA-P 14.1軟件對其進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，數(shù)據(jù)選擇標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除變量量綱差異，得回歸方程Y=-0.486 7X1＋0.224X2＋0.503 6X3-0.104X4-0.411 7X5-0.12X6-0.743 6X7-0.257 8X8＋0.632 2X9＋0.750 6X10＋0.140 1X11-0.439 3X12，其中回歸系數(shù)代表各自變量對藥效的貢獻(xiàn)大小，回歸系數(shù)越大對藥效貢獻(xiàn)越大，并且系數(shù)正值自變量與藥效正相關(guān)，負(fù)值與藥效負(fù)相關(guān)，偏最小二乘回歸模型回歸系數(shù)見圖2。模型診斷參數(shù)R2X=0.967，R2Y=0.998，Q2=0.713，表明該回歸模型具有較強(qiáng)的擬合解釋能力和模型預(yù)測能力［11］。

圖2 五味子抑菌譜效關(guān)系偏最小二乘回歸系數(shù)

3.4.2 變量重要性分析 在偏最小二乘回歸分析中，變量重要性反映了自變量X對因變量Y的解釋能力大小，變量重要性值越大，自變量X的解釋能力越強(qiáng)。結(jié)果見圖3。偏最小二乘回歸模型采用回歸系數(shù)和變量重要性值綜合評價各特征共有峰對抑菌活性的貢獻(xiàn)大小，按照各特征峰的回歸系數(shù)表明X2、X3、X9、X10、X11與抑菌活性呈正相關(guān)，且X2、X3、X9、X10、X11的變量重要性值均較大，在解釋因變量Y時具有顯著的重要性［12］。綜合評價各特征峰的貢獻(xiàn)小大排序?yàn)閄10＞X9＞X3＞X2＞X11。因此，可認(rèn)為峰10、9、3、2、11在UPLC-MS 特征圖譜上代表的化合物為五味子抗MRSA 抑菌活性物質(zhì)（群），且抑菌活性貢獻(xiàn)由大到小依次排列。經(jīng)分子式匹配軟件Elemental compositionTM計算處理，結(jié)合各化合物相對分子質(zhì)量和相對保留時間，經(jīng)過文獻(xiàn)檢索和相關(guān)數(shù)據(jù)庫對各主要分子離子峰以及高能量碰撞碎片信號進(jìn)行歸屬，對特征峰2、3進(jìn)行UPLC-MS／MS化合物定性鑒別。初步鑒定結(jié)果峰2為檸檬酸，峰3蘋果酸異構(gòu)體，化合物鑒定結(jié)果見表4。

表4 化合物成分鑒定結(jié)果

4 討論

偏最小二乘回歸分析具有不受數(shù)據(jù)多重相關(guān)性影響，可用于樣本數(shù)小于變量個數(shù)的數(shù)據(jù)分析，不需要像多變量相關(guān)性分析中的向前、向后以及逐步回歸法去除不顯著變量，是一種模型擬合度好和預(yù)測能力強(qiáng)的數(shù)據(jù)處理方法［13］。不同產(chǎn)地批號的五味子有著不同的抑菌活性，根本原因是含有抑菌活性成分（群）的質(zhì)和量的差異。本實(shí)驗(yàn)利用UPLC-MS 特征圖譜來呈現(xiàn)這種質(zhì)和量上的差異，采用偏最小二乘回歸分析對五味子抗MRSA 抑菌活性組分UPLC-MS 特征圖譜共有峰與藥效相關(guān)性研究，建立回歸模型，分析得到五味子中5種成分抗MRSA 抑菌活性貢獻(xiàn)較大，進(jìn)一步揭示了五味子抑菌活性藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為多個活性成分。通過UPLC-MS／MS 初步鑒定了2個貢獻(xiàn)較大的化合物，均為大極性有機(jī)酸，在后續(xù)的研究中利用色譜等相關(guān)分離技術(shù)以期得到化合物單體，進(jìn)一步鑒定化合物成分，驗(yàn)證化合物的抑菌活性。