劉惠婷，付遠(yuǎn)飛，郭宏雅，王 劍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心，廣東 廣州510006）

過(guò)敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種由免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的，以噴嚏、流涕、鼻塞、鼻癢為主要癥狀的臨床常見(jiàn)的非感染慢性炎性疾病，研究顯示其已影響著全球超過(guò)40%人口的生活質(zhì)量［1］。且近年來(lái)，包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)過(guò)敏性鼻炎發(fā)病率一直呈上升態(tài)勢(shì)［2］。而臨床上的治療效果仍不盡如人意，皮質(zhì)激素、抗組胺藥副作用較大且易反復(fù)，脫敏療法周期長(zhǎng)費(fèi)用高，過(guò)敏原篩檢難全面。目前已有多項(xiàng)研究提示中醫(yī)藥在過(guò)敏性鼻炎上確有安全性及療效性［3-5］。鼻沁滴鼻液在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下選取臨床經(jīng)驗(yàn)藥桂皮、牡丹皮、石菖蒲制成復(fù)方劑，以期通過(guò)局部鼻部給藥，探索過(guò)敏性鼻炎治療的新療法。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)豚鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（250±50）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002，于廣州中醫(yī)藥大學(xué)（中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用許可證號(hào)SYXK（粵）2018-0182。動(dòng)物一般狀態(tài)良好，無(wú)抓鼻、噴嚏、流涕、喘息現(xiàn)象，皮毛光亮，飲食及活動(dòng)正常。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥 麻苯滴鼻劑（廣東省中醫(yī)醫(yī)院自制，批號(hào)20171014）；鼻沁滴鼻液（廣州文翰生物科技有限公司，批號(hào)20180302）；卵白蛋白（廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，批號(hào)MB11671）；氫氧化鋁（分析純，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號(hào)20171218）；10% 中性甲醛固定液（北京酷萊博科技有限公司，批號(hào)20171020）；蘇木素伊紅染液（廣州秀威公司，批號(hào)180314）；小鼠卵清蛋白特異性IgE（OVA sIgE）ELISA 試劑盒（上海一基生物科技有限公 司，批 號(hào)Y13027A）；ELISA 試劑盒 IL-4（批 號(hào)1803101）、INF-γ（批號(hào)1803261）購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司。

1.3 儀器 VICTORX 多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；Excelsior AS 全密閉自動(dòng)脫水機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；HistoCore Arcadia H 石蠟包埋機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司）；RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司）病理圖像分析系統(tǒng)（BX46顯微鏡，DP27攝像頭，日本Olympus 公司）；

2 方法

2.1 造模、分組 雌雄各半隨機(jī)共取48只采用卵白蛋白（OVA）致敏法造模處理［6-7］。腹腔注射1 mL OVA 懸液（含0.9%氯化鈉，20 mg OVA，30 mg 氫氧化鋁），隔日1次，共8次（15 d）以基礎(chǔ)致敏；第16天開(kāi)始用10% OVA生理鹽水液滴入豚鼠兩前鼻孔，每側(cè)50 μL，2次／d，連續(xù)10 d 以激發(fā)過(guò)敏性鼻炎。造模成功后，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、鼻沁滴鼻液高、低劑量組，每組12只。另取12只為正常組，同前作腹腔注射及滴鼻，但給予藥物皆為生理鹽水。第27天，各組開(kāi)始給藥，即正常組、模型組用生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組用麻苯滴鼻液，鼻沁滴鼻液高、低劑量組分別用鼻沁原液、原液1倍稀釋液（生理鹽水稀釋），藥液均用鼻噴瓶呈霧狀噴入鼻腔內(nèi)，每側(cè)鼻孔50 μL，3次／d，連續(xù)4周。

2.2 行為學(xué)評(píng)分 在造模期及給藥期的末次給藥（第26、54天）后分別進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分以評(píng)價(jià)造模效果或給藥效果。依文獻(xiàn)［8］略加調(diào)整，具體為采用“疊加量化計(jì)分法”，在末次滴鼻0.5 h 內(nèi)觀察豚鼠下述表現(xiàn)并計(jì)分。鼻癢，輕搔鼻1～2次為1分，劇烈抓撓鼻面不止為3分，介于兩者間為2分；噴嚏，1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，11個(gè)以上為3分；喘息，呼吸急促為1分，加重并有明顯停頓感為2分，嚴(yán)重喘息為3分；流涕，流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。造模期總分＞5分表示鼻炎癥狀顯著，造模成功。

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 豚鼠取血后，迅速切除鼻部并分離出鼻黏膜，10%中性甲醛固定，后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、制作3 μm 厚的石蠟切片，并作HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察局部黏膜及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。

2.4 血清學(xué)指標(biāo) 末次給藥后1 h，各組豚鼠常規(guī)麻醉后腹主動(dòng)脈取血，6 000 r／min 離心5 min 后，取血清層，-20 ℃保存。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清IgE、IL-4、IFNγ 水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA）分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)第26天，造模結(jié)束，與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、鼻沁滴鼻液組，均出現(xiàn)明顯的抓鼻、噴嚏、流涕等典型鼻炎癥狀，評(píng)分顯著提高（P＜0.01），均大于5分，表明各組造模成功。藥物治療4周后，與模型組比較，陽(yáng)性組、鼻沁滴鼻液組評(píng)分均明顯下降（P＜0.05）。其中鼻沁滴鼻液高劑量組與陽(yáng)性組喘息基本不見(jiàn)，多偶見(jiàn)鼻癢。見(jiàn)表1。

表1 造模后及給藥后各組豚鼠鼻過(guò)敏癥狀評(píng)分比較（分，， n=12）

表1 造模后及給藥后各組豚鼠鼻過(guò)敏癥狀評(píng)分比較（分，， n=12）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 相較于正常組，模型組可見(jiàn)黏膜水腫，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)于黏膜下層，呈現(xiàn)典型的過(guò)敏性鼻炎病理學(xué)特征；而陽(yáng)性組與高劑量組黏膜腫脹充血程度較輕，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少；低劑量仍可見(jiàn)較多嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

3.3 血清學(xué)指標(biāo) 與正常組比較，模型組血清IgE、IL-4水平均明顯升高（P＜0.05），IFN-γ 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，麻苯滴鼻劑（陽(yáng)性藥）、鼻沁滴鼻液均可以有效較低IgE 和IL-4水平，并升高IFN-γ 水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

4 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為過(guò)敏性鼻炎屬于“鼻淵”“鼻鼽”，或因肺脾腎陽(yáng)氣虧虛，又感受風(fēng)寒之邪，或因少陽(yáng)郁熱、瘀血血熱、肺經(jīng)伏熱，熱擾鼻竅所致［9-10］。臨床上辨證施治，多采用溫陽(yáng)散寒、祛風(fēng)化濕、涼血活血之法［10-12］。鼻沁滴鼻液結(jié)合臨床選方用藥，以桂枝、石菖蒲、牡丹皮為原料，提取有效成份制成外用制劑，采用鼻腔內(nèi)噴霧給藥方式，使中藥液滴細(xì)霧化，充分作用于鼻腔黏膜，迅速被吸收發(fā)揮作用，提高了藥物在鼻炎病灶部位的生物利用度，且其芳香類成份還可以作用于鼻腔嗅神經(jīng)，興奮中樞神經(jīng)，符合中醫(yī)芳香開(kāi)竅的治則。桂枝，性味辛溫，歸屬肺經(jīng)，能解表散寒、溫通經(jīng)脈，是新感寒邪的良藥；石菖蒲，辛香溫燥，歸心、胃經(jīng)，可健脾化濕，豁痰開(kāi)竅；牡丹皮，苦辛微寒，屬心肝腎經(jīng)，既制桂枝、石菖蒲之溫，又能清熱涼血，活血化瘀，是久病之血熱血瘀的常用藥。三藥組方，通調(diào)肺脾腎，兼顧鼻淵新病久病?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，桂枝的主要活性成份桂皮醛，具有解熱鎮(zhèn)痛、擴(kuò)血管、抗炎抗過(guò)敏，可抑制IgE 誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒［13］。石菖蒲的主要有效單體α、β-細(xì)辛醚，可拮抗組胺-乙酰膽堿致喘的模型鼠的氣管平滑肌痙攣，有一定的抗過(guò)敏、平喘作用［14-15］。而丹皮的主要活性成份丹皮酚具有抗炎、擴(kuò)血管、改善微循環(huán)的作用［16］。故鼻沁滴鼻液的選用上述三味藥治療過(guò)敏性鼻炎，具有較充分的理論基礎(chǔ)。

圖1 給藥4周后各組豚鼠鼻黏膜HE 染色（×400）

圖2 各組豚鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ 水平

現(xiàn)代病理學(xué)研究認(rèn)為，2型輔助性T 細(xì)胞（Type 2 helper T cells，Th2細(xì)胞）在過(guò)敏性鼻炎的疾病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。過(guò)敏性鼻炎是與特征性血清IgE 水平升高密切相關(guān)的Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。一般認(rèn)為，粉塵、螨蟲(chóng)、花粉等過(guò)敏原接觸鼻黏膜，相關(guān)抗原或半抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞捕獲、吸收、處理后提呈給原始T 淋巴細(xì)胞（na?ve T cell，Th0細(xì)胞），促進(jìn)其激活其為Th2細(xì)胞。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等細(xì)胞因子，促發(fā)多種過(guò)敏性鼻炎的特征性癥狀。如TNF-α 能激活中性粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的活化和Ⅲ型膠原的降解；IL-3、IL-5、GM-CSF 能激活嗜酸性粒細(xì)胞釋放堿性蛋白引起上皮細(xì)胞損傷［17］；IL-4、IL-13在共刺激因子配體下能刺激并促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)B 細(xì)胞，以產(chǎn)生、分泌特異性抗體IgE。而IgE 富集于肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，在機(jī)體二次接觸過(guò)敏原后，與抗原特異性結(jié)合，促發(fā)典型的Ⅰ型超敏放應(yīng)［17-18］。早期肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放大量組胺、類胰蛋白酶、前列腺素D2等介質(zhì)，從而使局部血管擴(kuò)張、血管通透性增加、黏液分泌增多、感覺(jué)神經(jīng)敏化，出現(xiàn)黏膜水腫、鼻塞、鼻漏、鼻癢等癥狀。晚期肥大細(xì)胞和Th2細(xì)胞合成釋放的多種因子又募集更多的炎癥細(xì)胞，包括T 細(xì)胞，中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等以產(chǎn)生更多效應(yīng)［19］。以上可提示，Th0分化為Th2是過(guò)敏反應(yīng)的重要機(jī)制，IgE 是過(guò)敏性鼻炎發(fā)生的核心要點(diǎn)。

正常情況下，Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞，前者產(chǎn)生Th1型因子，如IFN-γ，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫；后者產(chǎn)IL-4、IL-5等Th2型因子，主要介導(dǎo)體液免疫。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 能夠抑制Th2細(xì)胞的活化，抑制IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子的分泌，從而抑制IgE 的產(chǎn)生，起抑制體液免疫的作用［20］。IL-4等也能通過(guò)抑制Th1細(xì)胞的活化，抑制細(xì)胞免疫［21］。結(jié)合過(guò)敏性鼻炎的臨床癥狀與體征，提示過(guò)敏性鼻炎是Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化增多而向Th1細(xì)胞分化減少，Th1／Th2失衡的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用OVA 建立的過(guò)敏性鼻炎豚鼠模型，能較全面且準(zhǔn)確的反映臨床過(guò)敏性鼻炎的各項(xiàng)特征，是世界上公認(rèn)的過(guò)敏性鼻炎模型之一［22］。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以桂枝、石菖蒲、牡丹皮為原料藥的制劑，其作用強(qiáng)度與揮發(fā)油濃度成正比，鼻沁滴鼻液在制劑工藝中加入增溶劑以最大溶解藥物揮發(fā)性成份，本實(shí)驗(yàn)以鼻沁原液為高劑量組，其半量濃度為低劑量組。我們發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組豚鼠鼻部組織形態(tài)的病理改變與其過(guò)敏性鼻炎癥狀嚴(yán)重程度相匹配，且與正常組相比，模型鼠特異性血清IgE、IL-4增加，IFN-γ 降低，符合過(guò)敏性鼻炎的Th1／Th2比例失衡的理論，而鼻沁滴鼻液能明顯下調(diào)過(guò)敏性鼻炎模型IL-4、IgE 的表達(dá)，上調(diào)IFN-γ 的表達(dá)，且高劑量組較低劑量組效果明顯，提示其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IL-4、IFN-γ 的表達(dá)以促進(jìn)Th1的活化、抑制Th2的活化，糾正Th1／Th2平衡，改善過(guò)敏性鼻炎的鼻部癥狀、減輕鼻黏膜損傷，提高過(guò)敏性鼻炎患者的生活質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論及現(xiàn)代藥理研究，創(chuàng)制新型的組分制劑，為過(guò)敏性鼻炎的治療提供了又一新的治療方法。而制劑的長(zhǎng)期試驗(yàn)、具體藥效成分的具體作用機(jī)制等，有待進(jìn)一步的研究。