陳學(xué)勛，孫己晶，劉葉偉，孫秀菊，李香玲，張海波，郭 民?

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261000；3.濰坊市峽山經(jīng)濟(jì)生態(tài)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院，山東 濰坊261000）

慢性腎臟病已成為全球健康問題，腎移植是終末期腎臟病的最佳治療方法［1］。腎移植面臨的最主要難題排斥反應(yīng)，研究證實(shí)，急性排斥反應(yīng)主要是T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，效應(yīng)性活化T 細(xì)胞CD3＋、CD4＋等的增殖，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的衰減所造成移植器官的損害［2］。雷公藤甲素（triptolide TPT）是從雷公藤中提取的抑制T 細(xì)胞增殖最強(qiáng)的有效成分，器官移植術(shù)中臨床和實(shí)驗(yàn)都證明了雷公藤甲素能夠通過抑制T 細(xì)胞增殖，上調(diào)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞而有效地延長移植物存活時(shí)間并且能夠預(yù)防移植物抗宿主病的發(fā)生［3-4］，具體機(jī)制可能通過多條信號(hào)通路途徑實(shí)現(xiàn)抗排斥反應(yīng)。程序性死亡配體（programmed death ligand 1，PD-L1）是屬于B7家族的一種抑制性共刺激分子，與程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）結(jié)合后，抑制活化T 細(xì)胞增殖，PD-1和PD-L1通過多途徑提供調(diào)節(jié)中樞和外周耐受的抑制信號(hào)，其中調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能是其重要的靶點(diǎn)，從而對(duì)移植器官有保護(hù)作用［5-6］。本研究旨在闡明PD-1／PD-L1信號(hào)通路在雷公藤甲素緩解腎移植急性排斥反應(yīng)中的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar 大鼠3個(gè)月齡，體質(zhì)量（200±15）g，來源于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20140007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)大鼠恒定的溫度（21±1）℃和濕度50%～70%。日／夜周期計(jì)算維持在12 h。所有程序均經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 試藥 雷公藤甲素（批號(hào)QZ000326，含有量≥98%）購于南京青澤醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展有限公司；anti-mouse PD-L1（批號(hào)AM85436）購于美國BioXcell 公司；血清肌酐試劑盒（批號(hào)180681）購于瑞士Roche 公司；ECL 試劑（批號(hào)A4306）購于德國Amersham Biosciences 公司；兔抗人PDL1一抗（批號(hào)160509201764）、HRP 標(biāo)記的IgG 二抗（批號(hào)1923102018132）購于美國CST 公司；RNA 提取試劑盒（批號(hào)4381662）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)1600533）購于美國R＆D Systems 公司。

1.3 儀器 手術(shù)器械均購自上海醫(yī)療器械公司；手術(shù)顯微鏡購于鎮(zhèn)江光學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD 公司；全自動(dòng)生化分析儀購于美國Beckman Instruments 公司；聚氟乙烯薄膜（P4502）購于美國Pall Life Sciences 公司。

2 方法

2.1 腎移植模型 選擇健康雄性Wistar 大鼠8只作為空白對(duì)照，健康雄性SD 大鼠32只作為供體，另取32只健康雄性Wistar 大鼠作為受體。供體大鼠建模前12 h 禁食，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定手術(shù)桌上，經(jīng)中線切口顯露左腎，結(jié)扎腎上腺動(dòng)靜脈分支，切斷腎動(dòng)脈，4 ℃灌流含肝素生理鹽水經(jīng)腹主動(dòng)脈至腎動(dòng)脈，然后分離輸尿管，將左腎靜脈連接導(dǎo)管后取出腎臟保存于4 ℃含肝素生理鹽水中。受體大鼠同樣步驟麻醉固定。受體腎暴露后移除，供腎通過導(dǎo)管連接，開放動(dòng)脈靜脈后移植腎供血發(fā)紅，尿液從輸尿管流出2～3 min。大鼠術(shù)后不限飲食，均接受青霉素（104 IU／kg）肌肉注射7 d。

2.2 雷公藤甲素（triptolide，TPT）溶劑配制 雷公藤甲素20 mg／支，加入二甲基亞砜1 mL，50 ℃超聲震蕩30 min，加注射用水配成含雷公藤甲素0.1 mg／mL 的溶液，除菌過濾分裝，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組 空白對(duì)照組8例不做任何處理；急性排斥（acute renal allograft rejection，AR）組，腹腔注射生理鹽水；雷公藤甲素組，腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg；anti-PDL1組，腹腔注射抗鼠程序性死亡配體1抗體（anti-mouse PD-L1）3 mg／d；雷公藤甲素＋anti-PD-L1組，同時(shí)腹腔注射雷公藤甲素0.25 mg／kg、anti-mouse PD-L1 3 mg／kg。從移植后當(dāng)日開始腹腔注射給藥，1次／d，直到大鼠臨近死亡處死，每組8只。

2.4 生長狀態(tài)和腎功能評(píng)價(jià) 記錄存活時(shí)間（d）、體質(zhì)量（g）和生理狀態(tài)，檢測血清肌酐水平。

2.5 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 腎移植后5 d 各組處死3只獲得腎組織，其余腎組織待大鼠萎靡不振，呼吸微弱，臨近死亡狀態(tài)時(shí)處死獲取，甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，脫水，進(jìn)行HE 和PAS 染色。按Banff 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)排斥反應(yīng)程度，根據(jù)炎癥因子浸入程度，腎間質(zhì)損害程度分為6級(jí)，正常、交界性改變、Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲa 級(jí)、Ⅲb 級(jí)。

2.6 mRNA 表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測。根據(jù)制造商的說明，用TRIZOL 提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA，提取總RNA。引物設(shè)計(jì)Primer 6.0和合成由Invitrogen 公司（表1）。進(jìn)行反應(yīng)，在55 ℃1 min，其次是35個(gè)周期的92 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃為35 s。GAPDH 作為內(nèi)參照。按2-△△CT方法計(jì)算結(jié)果。

表1 引物序列

2.7 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。液氮研磨后與RIPA 處理15～30 min，超聲波處理4次，5 s／次，4 ℃10 000g／min 離心5 min，取上清液?？偟鞍走M(jìn)行10% SDSPAGE 電泳分離和轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂奶2 h 封閉后，膜在PD-L1單克隆抗體（稀釋1 ∶1 000）孵育，4 °C 過夜。清洗后的膜PBST，進(jìn)一步加入二抗（稀釋1 ∶2 000）30 min，膜處理的ECL 為1 min，并在X 射線下曝光。Quantity One 軟件測定結(jié)合密度。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次。

2.8 T 細(xì)胞亞群檢測 移植后5 d 負(fù)壓方法收集腹主動(dòng)脈血，室溫靜置30 min 后，在4 ℃下3 600 r／min 離心，上清液保存于-20 ℃，腎組織保存于-80 ℃。流式試管4支，加入100 uL 抗凝后的外周血，試管一中加入5 μL 的CD3-PC5抗體，試管二管中加入5 μL 的CD4-FITC 抗體，試管三管中加入5 μL 的CD8-PE 抗體，試管四中分別加入5 μL的CD4-FITC 抗體和CD25-PE 抗體，低溫靜置1 h，然后添加裂解紅細(xì)胞試液5 mL，然后置于離心機(jī)上，設(shè)置半徑為8 cm，1 000 r／min，共計(jì)5 min，去除澄清部分，PBS 洗滌2次，使用FACS-Calibur 流式細(xì)胞儀器進(jìn)行檢測，使用PEMSS 4.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行收集與分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 生存狀態(tài)、腎功能 雷公藤甲素組大鼠具有良好的狀態(tài)，在腎移植的第15天開始出現(xiàn)排尿異常、萎靡不振和死亡；急性排斥組和雷公藤甲素＋anti-PD-L1組在第8天，Anti-PD-L1組在第5天就開始出現(xiàn)上述情況。與急性排斥組比較，雷公藤甲素組大鼠存活時(shí)間、體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05），anti-PD-L1組以上指標(biāo)顯著降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組以上指標(biāo)顯著高于anti-PD-L1組（P＜0.05）。與急性排斥組比較，雷公藤甲素組血肌酐水平顯著降低（P＜0.05），anti-PD-L1組顯著升高（P＜0.05），而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組顯著低于anti-PD-L1組（P＜0.05），見表2。

3.2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 急性排斥組典型急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)為彌漫的炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)細(xì)胞水腫變性，動(dòng)脈彌漫炎癥，皮質(zhì)出血等表現(xiàn)。anti-PD-L1組急性排斥反應(yīng)最為嚴(yán)重；雷公藤甲素組病理表現(xiàn)較其他各組均減輕，有2例交界性病理改變；雷公藤甲素＋anti-PD-L1組急性排斥反應(yīng)表現(xiàn)介于急性排斥組和雷公藤甲素組。見圖1、表3。

表2 生存狀態(tài)及腎功能情況（， n=8）

表2 生存狀態(tài)及腎功能情況（， n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP ＜0.05；與雷公藤甲素＋anti-PD-L1組比較，dP＜0.05

圖1 腎臟病理急性排斥分級(jí)（HE×200）

表3 腎臟病理Banff 分級(jí)（只， n=8）

3.3 在腎臟組織中PD-L1mRNA 和蛋白表達(dá) 與急性排斥組比較，雷公藤甲素組、雷公藤甲素＋anti-PD-L1組腎組織（PD-L）1 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），anti-PD-L1組表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 PD-L1蛋白在腎臟組織中的表達(dá)

3.4 T 細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比率 與急性排斥組比較，雷公藤甲素組CD3＋T、CD4＋T 細(xì)胞比率、CD4＋／CD8＋明顯降低，CD8＋T、CD4＋CD25＋細(xì)胞比率明顯升高（P＜0.05），anti-PD-L1組CD3＋T、CD4＋T 細(xì)胞比率、CD4＋／CD8＋明顯升高，CD8＋T、CD4＋CD25＋細(xì)胞比率明顯降低（P＜0.05）；而雷公藤甲素＋anti-PD-L1組則能顯著逆轉(zhuǎn)Anti-PD-L1組T 細(xì)胞比率（P＜0.05）。見表5。

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在腎臟組織中的表達(dá)（，n=8）

表4 PD-L1 mRNA 和蛋白在腎臟組織中的表達(dá)（，n=8）

注：與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP＜0.05

表5 T 淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比率（， n=8）

表5 T 淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比率（， n=8）

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與急性排斥組比較，bP ＜0.05；與anti-PD-L1組比較，cP ＜0.05；與雷公藤甲素＋anti-PD-L1組比較，dP＜0.05

4 討論

急性排斥反應(yīng)早期階段T 淋巴細(xì)胞在腎移植排斥反應(yīng)過程中占主導(dǎo)地位，CD3＋T 細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞［2，7-9］。活化的效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg T）的數(shù)量和活性降低，均在移植腎急性排斥反應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用［10-11］。本實(shí)驗(yàn)急性排斥組與對(duì)照組的大鼠腎臟病理及T淋巴細(xì)胞亞群等比較，病理上表現(xiàn)急性排斥，Banff 分級(jí)在Ⅰ-Ⅲb 級(jí)，炎性細(xì)胞浸潤，血肌酐顯著升高，效應(yīng)性CD3＋致［2，8-9］。表明CD3＋T 細(xì) 胞、CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T 細(xì) 胞、CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在急性排異反應(yīng)及誘導(dǎo)和維持免疫T 細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞、CD4＋／CD8＋顯著升高，CD8＋T 細(xì)胞、CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞顯著下降，與以往國內(nèi)外研究一耐受過程中起到關(guān)鍵性作用。

近年來的研究表明，程序性死亡配體（PD-L1）具有負(fù)性調(diào)節(jié)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)介導(dǎo)的T 細(xì)胞的活性［5，6，12-13］。許多實(shí)驗(yàn)證 明PD-1／PD-L1相互作用 抑制CD4＋T 細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)使細(xì)胞因子下降從而減輕排斥反應(yīng)［5，6，12-16］。前期實(shí)驗(yàn)觀察到腺病毒介導(dǎo)的PD-L1局部轉(zhuǎn)染的方式應(yīng)用于腎移植及其他器官移植，均可觀察到延長移植物的存活時(shí)間，減輕急性排斥反應(yīng)的程度［5，12，14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照大鼠腎臟組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)，只在活化的T 細(xì)胞表達(dá)，與以往學(xué)者研究相同［5，12-15］。建立大鼠急性排斥反應(yīng)，給予antimouse PD-L1阻斷PD-1／PD-L1后，PD-L1表達(dá)下調(diào)，炎癥狀態(tài)失控，與各組比較，出現(xiàn)大鼠生存狀態(tài)最差，腎功能最糟糕，存活時(shí)間最短，急性排斥反應(yīng)病理分級(jí)最嚴(yán)重，效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖明顯，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例明顯下降，與學(xué)者證實(shí)腎移植急性排斥反應(yīng)腎小管損害負(fù)相關(guān)一致［15-17］。說明阻斷PD-1／PD-L1信號(hào)通路加重腎移植急性排斥反應(yīng)，在其中起到重要作用。

雷公藤甲素是傳統(tǒng)中藥雷公藤的提取物，是雷公藤提取物中抑制已經(jīng)活化的T 細(xì)胞最強(qiáng)的單體，而對(duì)處于靜止期的T 細(xì)胞作用并不顯著［3-4］。實(shí)驗(yàn)證明，雷公藤甲素可通過多條途徑對(duì)于T 細(xì)胞的產(chǎn)生抑制作用，對(duì)多種T 淋巴細(xì)胞存在抑制作用，同時(shí)有提升對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的作用［3-4，18-19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素組大鼠腎臟組織中PD-L1表達(dá)顯著增加，抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞CD3＋T 細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞、CD4＋／CD8＋，CD8＋T 細(xì)胞、CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞顯著上升，從而使大鼠生存狀態(tài)最好，存活時(shí)間最長，腎功能狀態(tài)最佳，急性排斥反應(yīng)分級(jí)最輕，證實(shí)雷公藤甲素可使PD-L1的表達(dá)增強(qiáng)和增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比率，抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞活化，從而在抗排斥反應(yīng)中起到良好效果。

PD-L1和CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在T 細(xì)胞的活化、增殖、凋亡方面有密切的聯(lián)系，研究證實(shí)PD-1和PD-L1在Treg 上均有高表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的產(chǎn)生作用重大［20-21］。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)多種表面分子，主要包括抑制性共刺激分子CTLA-4、PD-1等抑制免疫反應(yīng)并且誘導(dǎo)和維持免疫耐受［20-22］。曾有報(bào)道應(yīng)用PD-L1單抗阻斷PD-1／PD-L1通路后抑制了CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的功能［20，23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可增加PD-L1表達(dá)，增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，從而減輕腎移植的排斥反應(yīng)，且另一組大鼠給予雷公藤甲素及anti-mouse PD-L1的腹腔灌注，阻斷了PD-1／PD-L1。不論是大鼠生存狀態(tài)，腎功能，存活時(shí)間，急性排斥反應(yīng)病理分級(jí)，還是效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比率等情況均差于雷公藤甲素組，卻好于anti-PD-L1組，說明阻斷PD-1／PD-L1通路降低了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率，減弱了其效能，使雷公藤甲素的抗排斥效果顯著下降，推測CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞是PD-1／PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)的雷公藤甲素抗腎移植急性排斥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)及機(jī)制。證明雷公藤甲素在緩解腎移植急性排異反應(yīng)中PD-1／PD-L1信號(hào)通路是其發(fā)揮抗排斥反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一。

綜上所述，本研究證實(shí)，雷公藤甲素可上調(diào)PD-L1基因表達(dá)，增加調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比率，抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的增殖，抑制移植排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時(shí)間。PD1／PD-L1可能在雷公藤甲素抗排斥反應(yīng)信號(hào)通路中發(fā)揮一定作用，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可能是PD-1／PD-L1信號(hào)通路介導(dǎo)的雷公藤甲素抗腎移植急性排斥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。