孫建華郜 潔劉開飛王焱皙李麗芳 鄧高丕?

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，嶺南醫(yī)學研究中心，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦兒中心，廣東 廣州510405；3.南方醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州510515；4.寧夏回族自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院暨中醫(yī)研究院，寧夏 銀川750021）

異位妊娠是指受精卵在子宮體腔以外著床［1］，發(fā)生率約為2%［2］。因輸卵管妊娠破裂導致的死亡占所有妊娠相關疾病死亡的2.7%，是出血性疾病死亡的首要因素［3］。輸卵管是異位妊娠最常見的種植部位，90%以上的異位妊娠發(fā)生在輸卵管［1］。西醫(yī)對輸卵管妊娠的管理包括手術治療、藥物治療和期待療法［4］。手術治療可造成生育功能破壞、輸卵管或盆腔組織粘連等，同時經(jīng)濟花費較高［5］。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為輸卵管妊娠治療的一線藥物［5］，可導致惡心、嘔吐、骨髓抑制、甚至死亡等嚴重的并發(fā)癥［4］。期待療法的成功率則非常依賴于病例選擇［4］。中藥保守治療符合用藥標準的輸卵管妊娠，往往能取得良好的臨床療效，同時保留了患者的生育功能?；鱿Y顆粒用于輔助治療早期輸卵管妊娠少腹血瘀證，是課題組總結、整理、優(yōu)化開發(fā)的廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。滋養(yǎng)細胞的侵襲遷移是輸卵管妊娠進展和最終導致輸卵管破裂的重要因素［6］。Integrin β3／FAK 通路為介導滋養(yǎng)細胞浸潤遷移的重要通路，本研究從該通路出發(fā)，探討化瘀消癥顆粒的殺胚機制，為后續(xù)臨床應用和深入基礎研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 化瘀消癥顆粒由丹參、赤芍、桃仁、紫草、天花粉組成，為廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（粵藥制字Z20170001），由廣州中醫(yī)藥大學藥學院制備，經(jīng)水提過濾、減壓濃縮，最終制備為凍干粉。用RPMI-1640將其配制成20 g ／L 儲存液，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝凍存于-20 ℃冰箱，實驗時根據(jù)需要稀釋至所需濃度。

1.2 細胞株 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8／SVneo 購買于美國ATCC 細胞庫，細胞培養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心。

1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素）（美國Gibco 公司）；PBS（美國Hyclone 公司）；CCK8試劑盒（日本同仁公司）；結晶紫染色液、RIPA（強）裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；4%多聚甲醛（北京雷根生物技術有限公司）；Matrigel Matrix 基質膠、Transwell 小室（美國BD 公 司）；integrin β3、E-cadherin、p-FAK、Src、p-Src、GAPDH 美國CST 公司），黏著斑激酶（FAK 美國Abcam 公司）；二抗（北京普洛麥格生物技術有限公司）；ECL 化學發(fā)光液（美國Bio-rad 公司）；RNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（RevertAid First Strand Cdna Synthesis Kit）、qPCR 試劑 盒（Maxima SYBR Green qPCR Master Mix）（美國Thermo 公司）；PCR引物設計及合成（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），常溫離心機、高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；生物安全柜（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；細胞計數(shù)儀（美國Nexcelom 公司）；超微量分光光度計（德國Lmplen 公司）；逆轉錄合成儀、凝膠成像系統(tǒng)、實時熒光定量核酸擴增儀、電泳儀及轉膜儀（美國Bio-rad 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 采用8%的FBS（含1%雙抗）在5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。當細胞融合至90%進行細胞傳代或種板，具體方法如下：吸棄原培養(yǎng)液，用PBS 輕輕漂洗細胞，吸棄PBS 加入適量0.25% 的胰酶，37 ℃消化2 min，加入8%的FBS 終止消化，輕輕吹打細胞使其懸浮，收集細胞懸液至15 mL 離心管進行離心（500 r／min，5 min），棄上清用8% FBS 重懸細胞，混勻后進行細胞計數(shù)，采用合適的細胞密度進行傳代或中板。

2.2 CCK8檢測HTR-8／SVneo 細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)后接種至96孔板（1×104／孔），每孔100 μL，貼壁24 h 進行加藥干預。實驗設置不同濃度化瘀消癥顆粒組（0.125、0.25、0.5、1、2 g／L）、陽性對照組（0.08 ng／L甲氨蝶呤）、對照組，分別培養(yǎng)12、24、48 h，每組設5個復孔。培養(yǎng)結束后，每孔加入10 μL CCK8繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀于450 nm 波長處測吸光度，實驗重復3次。細胞存活率=［（OD實驗組-OD空白組）／（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移 將6孔板底部水平畫線，取對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)后接種至板上（4×105／孔），每孔2 mL。分組為化瘀消癥顆粒組（0.5 g／L）、對照組、陽性對照組?；鱿Y顆粒濃度由CCK8實驗確定，化瘀消癥顆干預細胞48 h 半數(shù)抑制濃度（IC50）對應的中藥濃度。細胞融合約至90%，用200 μL 槍頭垂直用力劃痕，PBS 漂洗，按分組加入設定濃度的藥物溶液并拍照。24 h后再次拍照觀察各組細胞遷移距離。

2.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲 將matrigel 基質膠放于4 ℃過夜，用RPMI 1640培養(yǎng)液以1 ∶8稀釋基質膠，取80 μL 平鋪于Transwell 小室中，37 ℃孵育過夜，使膠凝固。種板前用RPMI 1640培養(yǎng)液水化30 min。采用取對數(shù)生長期的細胞消化計數(shù)后接種至Transwell 小室（2×104個／孔），每孔200 μL（1% FBS）。分組為化瘀消癥顆粒高、中、低劑量組（0.5、0.4、0.3 g／L）、對照組、陽性對照組。下室每孔加750 μL 10%的FBS，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，用4% 多聚甲醛固定15 min，甲醇透化5 min，0.1%結晶紫藍染色15 mim。顯微鏡下觀察各組細胞穿過小室基質膠的情況，并拍照計數(shù)。實驗重復3次。

2.5 qRT-PCR 檢測細胞相關基因表達 分組及干預同2.4項，采用Mazol 法提取細胞總RNA，進行濃度和純度測定，根據(jù)逆轉錄試劑盒提供的實驗步驟進行逆轉錄和PCR 反應。PCR 引物序列為E-cadherin引物，正向5’ -GAAAACAGCAAAGGGCTTGGA-3’，反向5′-TGGGGGCTTCATTCACATCC-3′；integrin β3引 物，正 向5′-TTGGAGACACGGTGAGCTTC-3′，反 向 5′-TTAGGTTCAGCTTGGGCCTG-3′。PCR 反應條件為95 ℃，1 0 min。95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃10 s；共40個循環(huán)。在65～95 ℃之間每0.5 ℃為升溫單位采集繪制溶解曲線。每組設3個復孔，實驗重復3次。采用2—△△Ct值計算目的基因表達量。

2.6 Western blot 檢測細胞相關蛋白表達 分組及干預同2.4項，干預24 h 后用RIPA 裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，進行蛋白濃度后加入loading buffer 進行煮沸變性。上樣，電泳，濕轉法轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1～2 h 后敷相應一抗（目的蛋白抗體1 ∶500～1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗（1 ∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜；ECL 化學發(fā)光后經(jīng)凝膠成像儀顯影；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。采用目的蛋白條帶灰度值／GAPDH 或磷酸化蛋白／總蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 20.0及graphpad prism 6.0進行處理，計量資料采用（）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊采用LSD 進行兩兩比較，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

3 結果

3.1 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞增殖的影響 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞活性的抑制作用呈時間和濃度依賴性。見圖1。

圖1 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞增殖的影響（n=3）

3.2 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞遷移的影響 化瘀消癥顆粒、甲氨蝶呤干預HTR-8／SVneo 細胞24 h 后，對照組HTR-8／SVneo 細胞向劃痕處遷移，化瘀消癥顆粒組劃痕面積較對照組變化較小。見圖2。

3.3 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞侵襲的影響 化瘀消癥顆粒、MTX 干預HTR-8／SVneo 細胞24 h 后，與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.4、0.5 g／L）可顯著抑制體外HTR-8／SVneo 細胞侵襲能力（P＜0.01），并呈濃度依賴性。與陽性對照組比較，化瘀消癥顆粒0.5 g／L 組侵襲細胞數(shù)減少（P＜0.01）。見圖3。

圖2 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞遷移的影響

圖3 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞侵襲能力的影響（n=3）

3.4 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞integrin β3、EcadherinmRNA 表達的影響 與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.3、0.4、0.5 g／L）明顯下調integrin β3 mRNA 表達，上調E-cadherinmRNA 表達（P＜0.05）。見圖4。

圖4 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞integrin β3、 E-cadherin mRNA 表達的影響（n=3）

3.5 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞integrinβ3、p-FAK、p-Src、E-cadherin 蛋白表達的影響 與對照組比較，化瘀消癥顆粒（0.4、0.5 g／L）E-cadherin 蛋白表達上調（P＜0.05，P＜0.01），integrinβ3及p-FAK 蛋白表達下調（P＜0.05）；化瘀消癥顆粒（0.3、0.4、0.5 g／L）p-Src 蛋白表達下調（P＜0.01）。見圖5。

4 討論

圖5 化瘀消癥顆粒對HTR-8／SVneo 細胞E-cadherin、integrin β3、p-FAK、p-Src 蛋白表達的影響（n=3）

在早期胚胎種植過程中，從胎盤滋養(yǎng)細胞（cytotrophoblast，CTB）到絨毛外滋養(yǎng)細胞（extra-villous trophoblast，EVT）轉化是胎盤植入的基本過程，細胞滋養(yǎng)細胞的侵襲過程類似于腫瘤細胞［7］。絨毛細胞滋養(yǎng)細胞黏附于子宮后，部分間質化形成EVT，從而獲得了侵襲遷移的能力，使得EVT 穿過子宮上皮細胞基底膜并向間質及其動脈浸潤［7-8］。細胞滋養(yǎng)細胞黏附于子宮后的生理過程涉及對基底膜或細胞外基質成分的附著、降解，并在被降解成分中遷移。在輸卵管妊娠中，EVT 侵襲和繼而發(fā)生的胎盤形成和正常宮內(nèi)妊娠有很多相似性［9-10］。

整合素屬于黏附分子家族，是由α 和β 亞基靠非共價鍵連接而成的異二聚體跨膜糖蛋白，介導細胞與細胞、基質與細胞間的黏附［11］。Integrinβ3和細胞外基質分子結合可以激活包括侵襲、遷移、增殖、存活等在內(nèi)的各種通路［11-12］。研究表明，Integrinβ3表達缺陷可以削弱滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力，使滋養(yǎng)細胞浸潤不足，從而促使先兆子癇形成［13］。黏著斑激酶是胞內(nèi)信號蛋白非受體酪氨酸激酶，位于整合素富集的黏著斑處，與細胞黏附和遷移密切相關［14-15］。FAK 有6個酪氨酸磷酸化位點，其中Tyr397位點是自磷酸化位點，其激活才能使FAK 結合原癌基因Src的位點暴露并與之結合從而使FAK 完全磷酸化，活化的FAK 和Src 復合物通過作用于其他蛋白激活下游信號通路，從而調節(jié)細胞不同的功能［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，整合素／FAK 信號通路在細胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮著重要作用［16］，F(xiàn)AK／src 信號通路亦和滋養(yǎng)細胞的侵襲遷移密切相關，抑制FAK／Src 信號通路可以明顯減弱滋養(yǎng)細胞的侵襲遷移作用，從而影響早孕 胚胎種植［17］。黏附分子Ecadherin 是參與上皮間質化及侵襲遷移的重要蛋白［18］，有研究對孕早期胎盤中CTB 和EVT 進行配對，并用PCR 探針比較相關基因的表達，結果表明在EVT 中E-cadherin 表達是下調的［18］，側面反映其低表達水平可促進滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移。

化瘀消癥顆粒中丹參、桃仁、赤芍、活血祛瘀止痛，并具有抗腫瘤之功［19-22］。紫草涼血活血，可抑制小鼠早期胚胎發(fā)育［23］。天花粉同具抑制腫瘤和抗生育之效［24-25］。本研究從侵襲遷移的角度，進一步探討化瘀消癥顆粒的作用機制。

課題組前期對體外培養(yǎng)的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞與正常宮內(nèi)早孕滋養(yǎng)細胞進行比較，結果發(fā)現(xiàn)二者增值能力、生長周期、外觀形態(tài)及侵襲能力相似［26-27］，故本研究選用人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8／SVneo 細胞為載體細胞進行化瘀消癥顆粒作用機制探索。

本實驗采用劃痕實驗檢測高、中、低劑量的化瘀消癥顆粒對滋養(yǎng)細胞遷移能力的影響，結果提示和陰性對照組相比，化瘀消癥顆粒組及陽性對照MTX 組中滋養(yǎng)細胞遷移距離均減小。Transwell 實驗表明高、中、低劑量的化瘀消癥顆粒均可抑制HTR-8／SVneo 細胞侵襲，并呈劑量依賴型，高劑量組抑制作用優(yōu)于陽性對照組。qRT-PCR 和Western blot 結果表明，化瘀消癥顆粒可以提高E-cadherin mRNA 和蛋白表達，降低integrin β3 mRNA 和蛋白表達及FAK、Src 的磷酸化水平。本研究提示化瘀消癥顆粒可能通過抑制integrin β3／FAK 信號通路抑制滋養(yǎng)細胞侵襲遷移。

綜上所述，化瘀消癥顆粒能抑制HTR-8／SVneo 細胞侵襲和遷移，其殺胚機制可能和調節(jié)整合素β3／FAK／Src 信號通路有關。