楊鵬飛，朱燁婷，方 旭，錢銀環(huán)，夏國華，于欣茗，楊 歡，沈玉萍?

（1.常州市金壇區(qū)人民醫(yī)院，江蘇 常州214000；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；3.鎮(zhèn)江市中醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江212003）

薯蕷皂苷元又名薯蕷皂素，是醫(yī)藥工業(yè)中用于合成激素類藥物的重要原料，被譽為“激素之母”，我國年產(chǎn)量為3 000～4 000噸，約占全世界年需求總量的70%［1］。近年來對該甾體類化合物生物活性的研究比較廣泛，發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤［2］、提高認知功能［3］、緩解神經(jīng)病理性疼痛［4］、保護甲亢性肝損害［5］等藥理作用，并能通過抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等來產(chǎn)生降血糖效果［6-7］，抑制甲狀腺細胞增殖，緩解甲狀腺腫大［8］，在相關(guān)新藥開發(fā)方面展現(xiàn)了巨大的潛力。

盾葉薯蕷Dioscorea zingiberensisC.H.Wright 為薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物，是世界上薯蕷皂苷元含有量最高的薯蕷品種。我國是其原產(chǎn)國，《山海經(jīng)》 中即有相關(guān)記載，長期以來在湖北等省份大面積種植，其根莖年產(chǎn)量大，是目前在工業(yè)實踐中用于生產(chǎn)薯蕷皂苷元的主要原材料［9］。

盾葉薯蕷根莖制備薯蕷皂苷元主要采用3種方法［10-13］，即直接酸水解法、索氏抽提-常壓酸水解法、雙相聯(lián)合酸水解法。但由于該部位淀粉、纖維素含有量豐富，故常需使用高濃度無機酸［14］，導(dǎo)致薯蕷皂苷元發(fā)生脫水、異構(gòu)化等副反應(yīng)；索氏抽提法消耗時間長，效率低；常壓下反應(yīng)溫度較低，導(dǎo)致薯蕷總皂苷水解不徹底，使得其得率偏低。本實驗采用加壓提取法從盾葉薯蕷根莖中得到薯蕷總皂苷，再以加壓雙相酸水解技術(shù)制備薯蕷皂苷元，與其他3種提取方法相比，具有耗時短、硫酸消耗量低、得率高等優(yōu)點，值得推廣應(yīng)用。

1 材料

AE240電子分析天平（0.01 mg），購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Alpha 1-2 LD 冷凍干燥機，購自德國Christ 公司；RZ6二級旋片真空泵，購自德國VacuuBrand 公司；GSH-0.5加壓反應(yīng)釜（內(nèi)膽PTFE 覆膜），購自威海坤昌化工有限公司；RHP-800高速多功能粉碎機，購自浙江永康榮浩工貿(mào)有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（1 L），購自上海亞榮生化儀器廠；Prominence 20AVP 高效液相色譜系統(tǒng)，由DGU-20A 脫氣機、LC-20AT 高壓泵、CTO-10AC 柱溫箱、FCV-10AL 混合器、SPD-20 A 紫外／可見光檢測器組成，購自日本Shimadzu 公司；N2000 SP1色譜工作站，購自浙江大學(xué)智達信息工程有限公司。

薯蕷皂苷元對照品（批號20120828，含有量≥98%），購自上海金穗生物科技有限公司。PTFE 針頭式微孔濾器（13 mm，0.22 μm），購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。乙腈為色譜純，購自美國OmniGene LLC 公司；濃硫酸、無水乙醇、石油醚（90～120 ℃）均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超純水（＞18.2 MΩ·cm）由Millipore MilliQ Biocel 純水機制備。

盾葉薯蕷根莖于2017年10月采自湖北省十堰市，經(jīng)鎮(zhèn)江市中醫(yī)藥藥劑科孫小祥副主任中藥師鑒定為正品，洗凈泥土后切片，冷凍干燥，粉碎后過40目篩，收集細粉，置于電子干燥箱（相對濕度＜40%）中保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［15］Waters XBridge Shield RP18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（70 ∶30）；分析時間15 min；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長202 nm；進樣量為20 μL。

2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取薯蕷皂苷元對照品15.50 mg，無水乙醇溶解并定容至10 mL，搖勻，配制成1 550 mg／mL 貯備液，二倍稀釋法依次稀釋成775.0、387.5、193.8、96.88、48.44、24.22、12.11 μg／mL 對照品溶液，0.22 μm 針頭式微孔濾器過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y=8 482.7X＋23 728.0（R2=0.999 9），在12.11～1 550 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 加壓提取法制備 精密稱取藥材粉末10.00 g，與一定體積乙醇混合后在加壓反應(yīng)釜中提取一段時間，提取液減壓回收乙醇后進行加壓雙相酸水解，即加入200 μL 濃硫酸定容至50 mL，再加入等量石油醚，于150 ℃下加壓水解2.0 h，其間100 r／min 持續(xù)攪拌，分取石油醚層，水洗至中性，減壓回收溶劑至干，殘留物以無水乙醇溶解并定容至100 mL，濾過，測定薯蕷皂苷元得率。

2.3.1 溫度 考察了溫度120～150 ℃對薯蕷皂苷元得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，當溫度從120 ℃升高到130 ℃時，薯蕷皂苷元得率從2.80% 增加到3.27%；進一步增加至150 ℃時，得率反而略有下降，故選擇溫度為130 ℃。

2.3.2 料液比 考察了料液比1 ∶10～1 ∶50對薯蕷皂苷元得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，當料液比從1 ∶10升高到1 ∶20時，薯蕷皂苷元得率從3.27%增加到3.46%；進一步增加至1 ∶50時，得率變化不大，綜合考慮保證充分提取和減少溶劑用量，選擇料液比為1 ∶20。

2.3.3 乙醇體積分數(shù) 考察了乙醇體積分數(shù)40%～70%對薯蕷皂苷元得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，當乙醇體積分數(shù)從40% 升高到60% 時，薯蕷皂苷元得率明顯增加，在60%時達到3.56%；進一步增加至70%時，得率反而有所下降，故選擇乙醇體積分數(shù)為60%。

2.3.4 提取時間 考察了提取時間0.5～4.0 h 對薯蕷皂苷元得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖可知，當提取時間為2 h時，薯蕷皂苷元得率較高，達3.56%；進一步延長時，得率反而略有下降，故選擇提取時間為2 h。

圖1 提取溫度（A）、料液比（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、提取時間（D）對薯蕷皂苷元得率的影響

2.4 直接酸水解法制備 精密稱取藥材粉末10.00 g，加入2.0 mol／L 硫酸200 mL，沸水浴中回流水解4 h，傾出，飽和石灰水中和，濾過，蒸餾水洗滌濾渣，80 ℃烘干后加入石油醚，索氏抽提24 h，減壓回收溶劑至干，殘留物以無水乙醇溶解并定容至100 mL，濾過，測定薯蕷皂苷元得率。

2.5 索氏抽提-常壓酸水解法制備 精密稱取藥材粉末10.00 g，加入甲醇，索氏抽提24 h，減壓回收溶劑至干，加入2.0 mol／L 硫酸200 mL，沸水浴中回流水解4 h，傾出，冷卻后用石油醚萃取，分取石油醚層，水洗后減壓回收溶劑至干，殘留物以無水乙醇溶解并定容至100 mL，濾過，測定薯蕷皂苷元得率。

2.6 雙相聯(lián)合酸水解法制備 精密稱取藥材粉末10.00 g，加入含6%硫酸的20%甲醇、石油醚各200 mL，沸水浴中回流萃取8 h，濾過，收集濾液，分取石油醚層，水洗后減壓回收溶劑至干，殘留物以無水乙醇溶解并定容至100 mL，濾過，測定薯蕷皂苷元得率。

2.7 指標計算 將按“2.3”～“2.6”項下方法制備的供試品溶液進行分析，計算薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度（C）、得率（Z）、變化率（I），公式為Z=C×100 mL／藥材質(zhì)量×100%、I=［（加壓提取法-傳統(tǒng)方法）／傳統(tǒng)方法］×100%。

2.8 加壓提取法與3種傳統(tǒng)方法的比較 表1顯示，加壓提取法制備時薯蕷皂苷得率與雙相聯(lián)合酸水解法接近，并高于直接酸水解法、索氏提取-常壓酸水解法，不僅硫酸消耗量大大降低，而且總耗時量也明顯縮短。由此可知，該方法得率更高，耗時更少，更綠色環(huán)保。

表1 加壓提取法與3種傳統(tǒng)方法比較（n=3）

3 討論與結(jié)論

直接酸水解、索氏抽提-常壓酸水解等傳統(tǒng)方法在對盾葉薯蕷根莖或其提取物以高濃度硫酸溶液進行長時間酸水解的過程中，經(jīng)常發(fā)生消除（3-OH 與4-H 脫水）、構(gòu)型轉(zhuǎn)換（25S→25R）、開環(huán)（F 環(huán)）等副反應(yīng)，而且會產(chǎn)生大量廢水排放，對環(huán)境造成的負面影響較大。本實驗利用由低濃度硫酸溶液和石油醚組成的雙相溶液構(gòu)筑酸催化反應(yīng)體系，可減少產(chǎn)物與酸的接觸，有效保護薯蕷皂苷元結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而有助于提高得率。

同時，本實驗優(yōu)化了加壓提取法從盾葉薯蕷制備薯蕷皂苷元的條件，即稱取藥材粉末10.00 g，與200 mL 60%乙醇混合后置入加壓反應(yīng)釜中，于130 ℃下提取2 h，提取液減壓回收乙醇，加入200 μL 濃硫酸定容至50 mL，再加入50 mL 石油醚（90～120 ℃），于150 ℃下加壓水解2.0 h，其間100 r／min 持續(xù)攪拌，分取石油醚層，水洗至中性，減壓回收溶劑至干。與3種傳統(tǒng)方法（直接酸水解法、索氏抽提-常壓酸水解法、雙相聯(lián)合酸水解法）比較，該方法提高了薯蕷皂苷元的得率，并且使耗酸量大幅減少，而且操作簡便易行，生產(chǎn)周期明顯縮短，可為解決目前我國薯蕷皂苷元生產(chǎn)工藝存在的得率低、污染重、周期長等一系列問題提供新的研究思路。但本實驗所得工藝研究尚處于實驗室規(guī)模，還需開展中試放大試驗進一步驗證和優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，以期為工業(yè)實踐奠定基礎(chǔ)。