丁興杰 蒲忠慧 熊 亮郭 力劉 菲?彭 成?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2.西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都611137）

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，其味辛、甘，性大熱，有毒，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛功效。附子多糖是附子有效成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保護(hù)心肌細(xì)胞、降血脂等作用［1］，近年來(lái)越來(lái)越受到重視［2-4］，目前相關(guān)工藝研究主要集中在提取上［5-7］，鮮有純化方面的報(bào)道。

透析法作為多糖經(jīng)典的除小分子化合物方法，能有效提高附子多糖純度，而且損失較少。本實(shí)驗(yàn)首次采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化附子多糖純化工藝，并進(jìn)行毒性研究，以期為該成分開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥 生附片（產(chǎn)地四川江油）購(gòu)自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高繼海副教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品。無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-200302，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。中性蛋白酶（批號(hào)16110902，南寧龐博生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（如吉生物科技有限公司）。95%乙醇、蒽酮、硫酸均為分析純（成都科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器 Lambda 35型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；LDZ5-2型離心機(jī)；DSY-1-6型電熱恒溫水浴器；電子分析天平（萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius 公司）；DB-211SC 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；MD34型透析袋（8 000～14 000 Da，美國(guó)Viskase 公司）；24孔板；移液槍。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.1.1 葡萄糖 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）。

2.1.2 蛋白質(zhì) 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的牛血清白蛋白對(duì)照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）

2.1.3 二硝基水楊酸（DNS）精密稱取DNS 0.65 g，適量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色量瓶中，依次加入NaOH 溶液（2 mol／L）32.5 mL、丙三醇4.5 g，定容，搖勻，放置7 d，即得。

2.1.4 考馬斯亮藍(lán) 精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250 100 mg，依次加入95%乙醇50 mL、85%磷酸100 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，即得，置于棕色瓶中備用。

2.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用苯酚-硫酸法。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1.5 mL，再加入5%苯酚2 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.5 mL，室溫下顯色25 min；另取蒸餾水2 mL，同法顯色，作為空白對(duì)照，于最大吸收波長(zhǎng)488 nm 處測(cè)定吸光度。以總糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程A=63.75X＋0.018（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用DNS 法。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于比色管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.3”項(xiàng)下DNS 試劑2 mL，搖勻，沸水浴3 min，加純水17 mL，于最大吸收波長(zhǎng)495 nm 處測(cè)定吸光度。以還原糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程A=21.72X-0.046（r=0.999 9），在0.015～0.035 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

“股份制”合作統(tǒng)一經(jīng)營(yíng)模式使橫溪塢村竹林逐步走向規(guī)?；?、集約化、效益化、品牌化的現(xiàn)代林業(yè)經(jīng)營(yíng)道路，實(shí)現(xiàn)了生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益的和諧統(tǒng)一，對(duì)當(dāng)?shù)剜l(xiāng)村振興發(fā)揮了更為積極有效的作用。

2.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用考馬斯亮藍(lán)法。精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.4”項(xiàng)下考馬斯亮藍(lán)溶液5 mL，顯色15 min，于最大吸收波長(zhǎng)590 nm 處測(cè)定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程A=52.6X＋0.092（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 純化工藝 采用單因素試驗(yàn)，確定提取工藝為5 g 藥材粗粉加40倍量水煎煮4 h，過(guò)濾，濾液離心，上清液加80%乙醇醇沉，低溫放置過(guò)夜，離心，沉淀用水復(fù)溶，Sevage 法除蛋白后用透析膜透析。然后，通過(guò)苯酚硫酸法、DNS 法［8］測(cè)定多糖含有量。

2.5.1 醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖損失率的影響 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至50%、60%、70%、80%、90%，靜置過(guò)夜，離心，加水復(fù)溶，測(cè)定多糖含有量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，醇沉體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)多糖損失率最低。

圖1 醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖損失率的影響

2.5.2 除蛋白方法對(duì)多糖含有量的影響 蛋白質(zhì)是粗多糖中最主要的雜質(zhì)，其存在增加了多糖吸濕性，而且所帶電荷可吸附大量其他雜質(zhì)和多糖，導(dǎo)致難以去除或分離［9］。取適量多糖溶于水，離心去沉淀，上清液分別用Sevage 試劑、三氟乙酸、中性蛋白酶除蛋白，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含有量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，雖然三氟乙酸法可將蛋白質(zhì)除盡，但也會(huì)使多糖大量降解；酶法雖也可除盡蛋白質(zhì)，但多糖含有量也較低，綜合考慮，選擇Sevage 法去除蛋白質(zhì)。

圖2 除蛋白方法對(duì)多糖含有量的影響

2.6 透析工藝 通過(guò)MD34透析袋（8 000～14 000 Da）對(duì)多糖進(jìn)行透析后，對(duì)透析時(shí)間、透析溫度、換液次數(shù)進(jìn)行單因素考察［10］。

2.6.1 透析時(shí)間 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，更換緩沖液4次，透析溫度20 ℃，考察透析15、20、25、30、35 h 對(duì)多糖純度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，透析30 h時(shí)多糖純度最高。

圖3 透析時(shí)間對(duì)多糖純度的影響

圖4 透析溫度對(duì)多糖純度的影響

2.6.3 換液次數(shù) 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，透析時(shí)間30 h，透析溫度40 ℃，考查換液3、4、5、6、7次對(duì)多糖純度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，隨著換液次數(shù)增加，多糖純度逐漸提高，在6次時(shí)最高，但在7次時(shí)反而稍有降低，可能是由于換液頻繁會(huì)使小分子聚合糖流失。

圖5 換液次數(shù)對(duì)多糖的影響

2.6.4 工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇透析溫度（A）、透析時(shí)間（B）、換液次數(shù)（C）作為影響因素，多糖純度（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

然后，應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得方程Y=-270.689 00 ＋3.451 45A＋6.200 10B＋64.378 00C-0.029 300AB＋0.024 500AC＋0.100 00BC-0.035 390A2-0.093 360B2-5.439 00C2，方差分析見(jiàn)表2。由表可知，模型具有顯著性（P＜0.05），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）；各因素影響程度依次為換液次數(shù)＞透析溫度＞透析時(shí)間；回歸方程擬合度和可信度均較高（R2=0.901 5，=0.884 6），預(yù)測(cè)性良好。

表2 方差分析

2.7 響應(yīng)面分析 通過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應(yīng)面，見(jiàn)圖6。由圖可知，最優(yōu)工藝為透析溫度36 ℃，透析時(shí)間31 h，換液次數(shù)6次，多糖純度為92.17%。

圖6 各因素響應(yīng)面圖

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至80%靜置過(guò)夜，離心，加水復(fù)溶，Sevage 法除蛋白，在透析溫度36 ℃、透析時(shí)間31 h、換液次數(shù)6次條件下進(jìn)行多糖透析，冷凍干燥，得無(wú)色透明膠狀多糖，稱定質(zhì)量，重復(fù)3次。結(jié)果，多糖提取率分別為9.64%、9.92%、9.58%，平均9.71%（RSD=1.85%）；純度分別為90.26%、92.71%、92.70%，平均91.89%（RSD=1.54%），與理論值92.17% 相當(dāng)，表明工藝優(yōu)化效果理想。

2.9 多糖毒性研究

2.9.1 心臟毒性 斑馬魚(yú)按雌雄比2 ∶1或1 ∶1的比例放入配魚(yú)缸中，次日早上利用光照刺激使其交配，待其產(chǎn)卵0.5～1 h 后，收集受精卵于胚胎培養(yǎng)液中，置于28.5 ℃孵箱中孵育48 h，其間每天更換胚胎培養(yǎng)液并棄除死卵，隨機(jī)分組放入24孔板中，每孔10只，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，斑馬魚(yú)繼續(xù)放入28.5 ℃孵箱中孵育。每12 h 觀察1次，記錄0.5 min內(nèi)心跳次數(shù)，同時(shí)觀察胚胎心包及心臟形態(tài)，重復(fù)3次，每次用同一批胚胎，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖可知，不同質(zhì)量濃度多糖對(duì)斑馬魚(yú)心率均無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖7 多糖對(duì)斑馬魚(yú)心率的影響

2.9.2 胚胎毒性 選擇受精后10 h 發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎，隨機(jī)分組放入24孔板中，每孔10枚胚胎，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，胚胎繼續(xù)放入28.5 ℃孵箱中孵育，每12 h 觀察1次，記錄胚胎死亡率，重復(fù)3次，每次用同一批胚胎，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖可知，不同質(zhì)量濃度多糖對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率均無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

圖8 多糖對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率的影響

3 討論

傳統(tǒng)多糖含有量測(cè)定方法大多為苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法［11-12］，這是因?yàn)槎嗵谴汲梁筮€原糖含有量可忽略不計(jì)，但在除蛋白過(guò)程中，各種試劑會(huì)造成多糖降解而產(chǎn)生還原糖，三氟乙酸法、中性蛋白酶除蛋白均是如此。由于多糖透析的目的是除去小分子還原糖，故本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法、DNS 法測(cè)定多糖含有量。

Box-Behnken 響應(yīng)面法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的多變量統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)［13］，可應(yīng)用于多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，能對(duì)幾個(gè)因素的相互影響作出全面統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)對(duì)擬合后的回歸方程進(jìn)行分析，以尋找最優(yōu)工藝參數(shù)，而且，它可更好地處理離散水平值，具有試驗(yàn)數(shù)相對(duì)較少、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行研究［14］。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化附子多糖純化工藝，不僅使多糖透析時(shí)間降低到31 h，比傳統(tǒng)工藝下的72 h 縮短一半以上，還將其純度提升到91.89%，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附子具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)的功效，但有大毒。本實(shí)驗(yàn)考察了附子多糖毒性，發(fā)現(xiàn)該成分無(wú)明顯心臟、胚胎毒性，安全性高，可為其開(kāi)發(fā)利用提供參考。