陳 榮，張華鋒

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州215104）

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃、金銀花、板藍(lán)根、苦杏仁、石膏、甘草、瓜蔞7味藥材，經(jīng)分步水提、醇沉、濃縮、制粒而成。主要用于治療上呼吸道感染、咳嗽、氣管炎等，臨床應(yīng)用廣泛［1］。作為一種常見兒科用藥，其原藥材種植、炮制、制劑生產(chǎn)加工、貯藏等過程中的重金屬及毒性元素污染問題更應(yīng)引起重視。

電感耦合等離子體質(zhì)譜因其樣品需求量少、動(dòng)態(tài)范圍極寬（＞10個(gè)數(shù)量級(jí)）、極低的檢出限（達(dá)ng／kg 級(jí)）、適用多種元素分析、可進(jìn)行同位素鑒別及測(cè)定、干擾較少且易于消除等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、地質(zhì)、環(huán)境等領(lǐng)域有非常重要的作用［2］。半定量分析是根據(jù)各元素的響應(yīng)因子，對(duì)未知樣品中所有元素進(jìn)行粗定量。對(duì)于全定量來說，半定量這一手段可以幫助更有針對(duì)性地檢測(cè)元素、估算標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度范圍、優(yōu)化內(nèi)標(biāo)選擇。目前針對(duì)中藥材、中成藥的元素全定量分析已成為常規(guī)檢驗(yàn)手段，半定量分析在食品、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)急監(jiān)測(cè)中應(yīng)用也時(shí)有報(bào)道［3-4］，左甜甜等［5］應(yīng)用半定量方法篩查了13種中藥材的重金屬及有害元素，但將半定量分析與全定量結(jié)合應(yīng)用在中藥制劑方面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以小兒咳喘靈為例，經(jīng)微波消解后，采用ICPMS 半定量方法進(jìn)行全元素的掃描和濃度預(yù)估，再利用全定量方法對(duì)部分含有量較高或重金屬、有害元素進(jìn)行定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 7900電感耦合等離子體色譜（美國Agilent 公司）；CEM MARS6微波消解儀（美國培安公司）；Mettler Toledo XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Millipore Synergy 超純水機(jī)（美國密理博公司）。

1.2 試藥 混合對(duì)照品溶液（含Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn 各10μg／mL，批號(hào)3-148MKBY2）、內(nèi)標(biāo)溶液（含 Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb 各100 μg／mL，批號(hào)3-189MKBY2）和調(diào)諧液（含Ce、Co、Li、Mg、TI、Y 各 1μg／L，批 號(hào) 24-19GST2）均購于美國Agilent 公司，Hg 單元素對(duì)照品溶液（1000μg／mL，批號(hào)174026-3）購于國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。硝酸為UP 級(jí)（蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司），水由Millipore Synergy 超純水機(jī)制得。小兒咳喘靈顆粒為收集市售樣品，涉及12個(gè)廠家，26批次。具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1.1 內(nèi)標(biāo)、參比溶液 精密量取質(zhì)量濃度為100 μg／mL 的內(nèi)標(biāo)溶液適量，加入2%硝酸配制成質(zhì)量濃度分別為1、100 ng／mL 的混合溶液，其中1 μg／mL溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，100 ng／mL 溶液作為半定量測(cè)定的參比溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成每1 mL 含各元素均為0、1、5、10、50、500 ng 的系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液。同時(shí)用2%硝酸溶液將汞單元素對(duì)照品溶液，稀釋成每1 mL 含汞0、0.5、1、1.5、2 ng的系列對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 取供試品0.4 g，精密稱定，加入硝酸8 mL，90 ℃預(yù)消解30 min，放冷，密塞，微波消解（消解程序?yàn)? 400 W，120 ℃，爬坡5 min，保持10 min；185 ℃，爬坡10 min，保持25 min，放冷，取出，用超純水轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，并沖洗3次，定容，作為供試品溶液。同法制備空白對(duì)照品溶液。

2.2 半定量分析

2.2.1 半定量分析儀器參數(shù) 氦反應(yīng)模式；采集方式為質(zhì)譜圖；峰型取6個(gè)點(diǎn)；積分時(shí)間0.1 s；重復(fù)次數(shù)1；掃描次數(shù)100；半定量分析；樣品提升速度0.3 r／s，提升時(shí)間20 s，穩(wěn)定時(shí)間20 s；等離子體流量15 L／min；射頻功率1 550 W；載氣流量1.09 L／min。

2.2.2 半定量測(cè)定方法 檢測(cè)包括m／z為7至238的所有質(zhì)量數(shù)，依次采集儀器背景噪音（超純水）、參比溶液、空白對(duì)照溶液、8批樣品溶液（編號(hào)1～8）數(shù)據(jù)，以參比溶液元素響應(yīng)值及濃度值，計(jì)算并更新半定量響應(yīng)因子，用于8批樣品的元素種類篩查及濃度測(cè)定。

2.2.3 半定量分析結(jié)果 8批樣品經(jīng)半定量分析，顯示元素Li～U 中的75種元素的每秒計(jì)數(shù)（CPS值）及濃度值，通過與背景噪音、空白對(duì)照的CPS值、濃度值比較，計(jì)算各同位素間CPS 比值是否與其豐度比值對(duì)應(yīng)等方式判定各個(gè)元素是否存在或有無定量必要。另外排除內(nèi)標(biāo)元素、部分非金屬元素（N、P、S、O、Si 等），以及考慮到重金屬元素及有害元素（Pb、Cd、As、Hg、Cu）篩查的必要，綜上考慮，選擇混合對(duì)照品溶液中Ag、Al、As、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、K、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Sr、V、Zn 以及單元素Hg進(jìn)行定量測(cè)定。部分元素半定量結(jié)果見表2。

2.3 全定量分析

實(shí)驗(yàn)材料有芹菜、蘆蒿、無機(jī)堿,實(shí)驗(yàn)儀器有電動(dòng)攪拌機(jī)(7312-I型,上海標(biāo)本模型廠制造)、恒溫水浴鍋(HH-S,)、旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)(NDJ-1型，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司)、電子分析天平(AB204-N型，梅特勒-托利多儀器有限公司).

2.3.1 全定量分析儀器參數(shù) 氦反應(yīng)模式；峰型取3個(gè)點(diǎn)；重復(fù)次數(shù)3；掃描次數(shù)100；全定量分析；一般元素積分時(shí)間設(shè)置為0.3 s，靈敏度度、難電離元素延長積分時(shí)間（Hg 為2 s，As、Cd 為1 s），采用虛擬內(nèi)標(biāo)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)修正，其余參數(shù)與半定量分析一致。

2.3.2 全定量分析方法 根據(jù)半定量分析中各元素濃度范圍，結(jié)合對(duì)照品溶液線性范圍，將供試品溶液用于Ag、Al、As、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Mn、Ni、Pb、Rb、Sr、V、Zn 及Hg的測(cè)定，另將供試品溶液再稀釋50倍用于Na、Mg、K 的測(cè)定。依次采集系列濃度混合對(duì)照品溶液、空白對(duì)照溶液、26批樣品溶液（編號(hào)1～26）、50倍稀釋后的26批供試品溶液、系列濃度汞元素對(duì)照品溶液數(shù)據(jù)，同時(shí)引入內(nèi)標(biāo)監(jiān)測(cè)儀器狀態(tài)。

表2 部分元素半定量測(cè)定結(jié)果（mg／kg）Tab.2 Semi-quantitative results of several elements（mg／kg）

2.3.3 方法學(xué)

2.3.3.1 線性關(guān)系和檢出限 以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、CPS 值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，各元素線性關(guān)系良好。連續(xù)采集樣品空白溶液11次，以其CPS 值標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，結(jié)果見表3。

表3 22種元素線性關(guān)系及檢出限Tab.3 Linear relationships and detection limit of twenty-two elements

2.3.3.2 精密度試驗(yàn) 將10 ng／mL 混合對(duì)照品溶液以及含汞為1 ng／mL 對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算出22種元素RSD，除K、Al、Ca、Hg分別為6.7%、6.1%、5.4%、5.7%外，其他元素為0.2%～2.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)1（批號(hào)1707033）的供試品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定除Na、Mg、K 外的其他元素，各元素RSD 為0.4%～5.1%。將上述供試品溶液，分別稀釋50倍，用于測(cè)定Na、Mg、K，3種元素RSD 分別為1.6%、0.8%、1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 將已知各元素含有量的編號(hào)1供試品取6份，精密加入10 μg／mL 混合對(duì)照品溶 液200 μL，1 μg／mL 汞對(duì)照品 溶液25 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算22種元素平均回收率，各元素加樣回收率為90.5%～115.1%。

2.3.4 全定量分析結(jié)果 22種元素全定量測(cè)定結(jié)果見表4～5，以全定量結(jié)果為真值，編號(hào)1～8號(hào)樣品中除Ca、Fe、Ga、Na、Mg、K 元素外，其他元素半定量測(cè)得值的相對(duì)偏差均小于±20%，且2種測(cè)量模式下的濃度范圍基本一致。參照國際人用藥物注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）Q3D 元素雜質(zhì)指南，將測(cè)定元素分為1類（Pb、As、Cd、Hg）、2A 類（Co、Ni、V）、2B 類（Ag）、3類（Ba、Cr、Cu）、其他（Al、Ca、Fe、Ga、Mn、Rb、Sr、Zn、Na、Mg、K）［6］。其中1類元素和Cu 根據(jù)2015年版《中國藥典》 中對(duì)甘草等重金屬含有量及有害元素含有量限定標(biāo)準(zhǔn)［7］，26批樣品中，Pb均小于5 mg／kg；As 均小于2 mg／kg；Cd 均小于0.3 mg／kg；Hg 均小于0.2 mg／kg；Cu 均小于20 mg／kg。2A 類元素中Co 均小于0.4 mg／kg，V均小于0.1 mg／kg，參照2015年版《中國藥典》對(duì)Ni 的最嚴(yán)要求（≤1 mg／kg，輔料硬脂酸、氫化大豆油等），編號(hào)4～5、25～26均超過標(biāo)準(zhǔn)。2B 類Ag 均小于0.06 mg／kg，3類中Ba 元素含有量編號(hào)25～26明顯高于其他批次，此外這2個(gè)批次的Pb、Al、Ca、Mn、Rb、Sr、Zn、Mg、K 均明顯偏高，表明生產(chǎn)這2個(gè)批次的四川L 廠在生產(chǎn)工藝上與其他廠家存在明顯差異，原藥材元素轉(zhuǎn)移進(jìn)入制劑中的量偏高。參照2015年版《中國藥典》 中對(duì)膠囊用明膠中鉻的限值（不得過百萬分之二），編號(hào)4的Cr 含有量超標(biāo)了7倍。

表4 26批樣品根據(jù)ICH Q3D 分類1類～3類元素測(cè)定結(jié)果（mg／kg）Tab.4 Full quantitative results of 1-3 types of elements according to the classification of ICH Q3D in twenty-six batches of samples（mg／kg）

表5 26批樣品中其他11種元素測(cè)定結(jié)果Tab.5 Full quantitative results of other eleven elements in twenty-six batches of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用微波消解法聯(lián)合ICP-MS 對(duì)小兒咳喘靈顆粒進(jìn)行了半定量全元素掃描和全定量測(cè)定。半定量測(cè)定結(jié)果，為全定量中元素種類選擇和對(duì)照品溶液濃度配制提供了參考。將2種模式下的定量結(jié)果進(jìn)行比較，半定量能給出較為準(zhǔn)確的元素濃度范圍，本實(shí)驗(yàn)中除Ca、Fe、Ga、Na、Mg、K 外，其他元素的準(zhǔn)確率均達(dá)到80%以上，這可能與參比溶液元素種類以及供試品中元素濃度與之接近程度相關(guān)，參比元素種類越多、范圍分布越廣，獲得的半定量結(jié)果就越加準(zhǔn)確［8］。供試品中如Na、K、Mg、Ca 等常量元素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于參比濃度，半定量值相對(duì)誤差就會(huì)偏大。

全定量對(duì)照品溶液的配制，直接關(guān)系定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，由于各元素間量相差數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，要兼顧痕量、微量、常量元素的準(zhǔn)確測(cè)定，勢(shì)必要擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍。但考慮到標(biāo)準(zhǔn)曲線的權(quán)重，本實(shí)驗(yàn)分2步稀釋，第1次稀釋50倍用于痕量、微量元素測(cè)定，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中去除最高點(diǎn)（500 ng／mL）再進(jìn)行線性擬合，第2次再稀釋50倍用于常量元素測(cè)定，在標(biāo)曲中去除最低點(diǎn)（1 ng／mL）后進(jìn)行線性擬合。所有檢測(cè)元素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999 5）。

本實(shí)驗(yàn)參考2015年版《中國藥典》 部分藥材和輔料中對(duì)重金屬元素及有害元素的限值規(guī)定，發(fā)現(xiàn)部分樣品存在Cr、Ni 超標(biāo)，而且集中在個(gè)別廠家，提示該廠家的藥材來源存在問題，也可能在生產(chǎn)過程引入了金屬催化劑鉻和鎳。參照美國NSF／ANSI 173-2010標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)“膳食補(bǔ)充劑”原材料中重金屬限值規(guī)定（Cr6＋≤2.0 μg／g）［9］，該廠家樣品中毒性較高的Cr6＋是否超標(biāo)還需進(jìn)一步確證，可通過聯(lián)用液相或離子色譜等方法實(shí)現(xiàn)［10］。由于本實(shí)驗(yàn)共定量測(cè)定了22種元素，并未全部覆蓋USP 232／233和歐洲藥物評(píng)審委員會(huì)（EMEA）收載的全部元素雜質(zhì)及金屬催化劑［11］，如Pt、Ir、Ru、Rh、Os 等，在缺乏相應(yīng)對(duì)照品溶液的情況下，對(duì)于一些問題比較突出的樣品，可以單獨(dú)進(jìn)行半定量掃描，驗(yàn)證有無其他元素殘留。

小兒咳喘靈顆粒的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并無重金屬及有害元素的限度規(guī)定［12-13］，如不對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大范圍的元素測(cè)定，很難發(fā)現(xiàn)其他有害元素的殘留。但目前針對(duì)中藥制劑的有害元素殘留量并無統(tǒng)一規(guī)定，2015年版《中國藥典》 僅對(duì)部分中藥限制了Pb、Cd、As、Hg、Cu 的量，ICH Q3D 元素雜質(zhì)指南亦不適用于中藥制劑，因此建立中藥材和中藥制劑范圍較廣的有害元素限量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。

本實(shí)驗(yàn)建立的ICP-MS 半定量篩查方法準(zhǔn)確度較高，操作簡便，與全定量相結(jié)合，檢查26批小兒咳喘靈顆粒的元素種類及部分元素含有量，為中藥制劑特別是在成分復(fù)雜、有害元素種類未知的情況下，提供范本。也為中藥制劑質(zhì)量控制及有害元素的快速檢測(cè)提供依據(jù)。