潘星宇，楊 林，張 升?

（1.海寧市第二人民醫(yī)院，浙江 海寧314419；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州310013）

阿霉素（Doxorubicin，DOX），又稱多柔比星，是臨床上廣泛用于治療各類惡性腫瘤的蒽醌類化療藥物。然而嚴重的劑量依賴性心臟毒副作用影響了阿霉素的臨床使用空間［1-2］。阿霉素致心臟毒性的機制尚不完全清楚，傳統(tǒng)研究認為，阿霉素的心臟毒性主要因為阿霉素在體內(nèi)代謝后生成半醌自由基，進而接到氧自由基損傷心肌細胞［3］。而在近些年的研究中發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導(dǎo)的心肌組織炎癥在阿霉素心臟毒性機制中發(fā)揮著重要的作用［4］。

參麥注射液（Shenmai Injection，SMI）源于參麥散名方，由人參、五味子、麥冬組成，經(jīng)現(xiàn)代制劑工藝加工成的注射制劑。具有益氣固脫，養(yǎng)陰生津的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)證明參麥注射液具有抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用［5-6］。臨床上參麥注射液被廣泛用于治療心腦血管疾病，因此本實驗通過研究參麥注射液拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌炎癥損傷來揭示參麥注射液的抗炎作用，并通過研究NF-κB 通路的變化揭示在參麥注射液的抗心肌炎分子機理。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康SD 大鼠，50只，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司供應(yīng)。動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%的條件下。在整個試驗期間，大鼠自由飲水，喂養(yǎng)60Co 輻照的全價營養(yǎng)顆粒飼料，由南京安立默科技有限公司生產(chǎn)供應(yīng)。

1.2 試藥 阿霉素由武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)，含有量為99%，批號20170723。參麥注射液購自于正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1804205。IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒產(chǎn)自武漢華美科技有限公司；p-NF-κB、NF-κB 一抗由CST 生產(chǎn)，β-actin 一抗、HRP 二抗購自于上海碧云天公司。

1.3 儀器 電泳儀為Bio-rad 垂直電泳槽；顯影儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，ChemiScope）；生化儀（日本日立公司）；心臟超聲檢測系統(tǒng)（加拿大，Vevo 1100）。

2 方法

2.1 分組及給藥 50只健康SD 大鼠，雌雄各半，隨機分為正常組、模型組（15 mg／kg 阿霉素）及參麥注射液低、中、高劑量組（0.1、0.3、1 g／kg），每組10。對照組按1 mL／100 g 劑量于實驗第1、3、5、7天分別給予生理鹽水；模型組實驗第1、3、5天給予等容量的生理鹽水，于第7天給予阿霉素15 mg／kg；參麥注射液組于實驗第1、3、5天給予不同劑量（0.1、0.3、1 g／kg）的參麥注射液，于第7天給予阿霉素15 mg／kg。所有組動物于靜脈注射阿霉素72 h 后（實驗第10天）麻醉做心臟超聲檢查。超聲檢查結(jié)束后腹主動脈收集各大鼠外周血用于血清心肌酶檢測；血液收集后處死大鼠收集各組大鼠心臟備用。

2.2 心臟功能超聲檢測 各組動物檢測時通過吸入3%濃度的異氟烷進入麻醉，繼而以吸入1%濃度的異氟烷維持麻醉。動物麻醉后，背位固定，左胸前區(qū)脫毛待檢。當(dāng)大鼠心率趨于持續(xù)性、穩(wěn)定性時開始檢測，在進行超聲過程中保持大鼠正常的生理狀態(tài)。以高頻探頭進行定位，將探頭至于左胸部，取胸骨旁短軸切面，置于二尖瓣腱索水平，M模式超聲心動評價心臟運動，分別檢測心率（HR）和心搏出量（CO），計算射血分數(shù)［EF（%）］。

2.3 血清生化學(xué)檢測 各組大鼠外周血收集后，靜止30 min 后，2 500 r／mim 離心15 min，收集上清。使用日立全自動血清生化儀檢測血清中的心肌相關(guān)酶（AST、LDH、CK-MB）。

2.4 心臟組織中炎癥因子檢測 取各組大鼠心臟0.1 g，加入1 mL 生理鹽水后勻漿，1 500 r／min離心后收集上清液。按試劑盒步驟進行ELISA測定。

2.5 炎癥通路相關(guān)蛋白檢測 各組大鼠剪取各心臟組織約0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，組織勻漿機充分勻漿，裂解30 min 后，12 000g／mim 離心10 min，收集上清。采用BCA 法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST 洗膜3次，使用TBST 稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育90 min，TBST 洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J 軟件進行條帶分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 和SPSS 統(tǒng)計分析進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析；多重比較用LSD 法，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參麥注射液對大鼠心肌功能的影響 正常組大鼠心臟大小正常，心肌厚度均一，心臟搏動有力、平穩(wěn)，心包無積液，未見心房與靜脈回流；模型組大鼠可見心室肌增厚，心臟搏動減慢且出現(xiàn)搏動不規(guī)律，偶見靜脈回流；參麥注射液組大鼠心肌增厚現(xiàn)象消失，心臟搏動恢復(fù)正常，未見心包積液或靜脈回流。與正常組比較，模型組大鼠心率、心搏出量、射血分數(shù)顯著降低（P＜0.01）；參麥注射液（0.3、1 g／kg）組大鼠心率、心搏出量、射血分數(shù)顯著上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

3.2 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響 與正常組比較，模型組心肌酶指標（AST、LDH、CKMB）水平顯著上升（P＜0.01）。與模型組比較，參麥注射液高劑量組心肌酶指標水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；中劑量組LDH、CK-MB 水平均顯著下降（P＜0.05）。見表1。

表1 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

表1 參麥注射液對大鼠血清心肌酶的影響（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

圖1 參麥注射液對大鼠心肌功能的影響（n=10）Fig.1 Effects of SMI on myocardial function in rats（n=10）

圖2 參麥注射液對大鼠心肌組織中炎癥因子的影響Fig.2 Effects of SMI on myocardial inflammatory factors in rats

3.3 參麥注射液對大鼠心肌炎癥因子的影響 圖2表明，與正常組比較，模型組大鼠心臟組織中促炎因子IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10水平顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，參麥注射液高劑量組能顯著逆轉(zhuǎn)以上炎癥因子水平（P＜0.05，P＜0.01）；而參麥注射液低、中劑量組能明顯上調(diào)IL-10水平（P＜0.01）。

3.4 參麥注射液對大鼠心肌組織NF-κB 磷酸化的影響 與正常組比較，模型組p-NF-κB 蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；經(jīng)參麥注射液干預(yù)后，給藥組大鼠心臟組織內(nèi)p-NF-κB 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

4 討論

阿霉素作為蒽醌類藥物，具有廣譜的抗腫瘤活性，但也同時因為存在急性、亞慢性和慢性的心臟毒性使臨床使用受限［8］。參麥注射液源于《病因脈治》 中的參冬飲。主要用于益氣固脫，養(yǎng)陰生津，生脈。用于治療氣陰兩虛之冠心病、病毒性心肌炎和慢性肺心病。參麥注射液是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代制劑工藝結(jié)合產(chǎn)生的中藥注射劑，臨床上用于治療心血管疾病。同時參麥注射液能夠提高腫瘤病人的免疫機能，與化療藥物合用時有增效作用，因其自身也具有一定的抗腫瘤活性，在臨床上常用于抗腫瘤的輔助用藥［7］。本研究也驗證了參麥注射液聯(lián)合化療藥物使用時能夠保護心臟組織，為中醫(yī)藥臨床研究提供了臨床前實驗數(shù)據(jù)，指導(dǎo)臨床對參麥注射液的開發(fā)使用。

圖3 參麥注射液對大鼠心肌組織p-NF-κB 蛋白表達的影響（n=10）Fig.3 Effects of SMI on the expression of p-NF-κB protein in rat myocardia（n=10）

阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性機制具有多樣性的特點，尚未完全明確。一般認為氧化應(yīng)激是阿霉素心臟毒性的主要毒理機制，而其他如細胞代謝異常，損傷細胞線粒體和炎癥反應(yīng)也被視為阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的重要因素［9］。事實上，臨床中發(fā)現(xiàn)阿霉素的使用能夠激活機體固有免疫，釋放炎癥因子導(dǎo)致心臟病理性改變［10］。參麥注射液通過提高機體免疫功能，降低炎癥因子的釋放，改善心肌組織炎癥反應(yīng)保護心肌組織［11］。本實驗一次性注射給予15 mg／kg 阿霉素造成大鼠急性心臟毒性，心肌組織中IL-6和TNF-α 等促炎因子升高和IL-10抗炎因子降低。IL-6和TNF-α 可通過增加中性粒細胞和吞噬細胞的功能，激活大量的過氧化物陰離子，從而引發(fā)自由基攻擊細胞膜及其細胞器的磷脂膜，導(dǎo)致心肌細胞損傷。又由于心肌細胞本身不具有再生的功能，心肌細胞損傷容易誘發(fā)心臟收縮和舒張障礙，心率（HR）下降，心肌泵血能力（CO、EF）降低等心臟功能異常。在大鼠外周血血清中檢測到AST、LDH 和CK-MB 等心肌酶升高也證實了阿霉素的急性損傷作用。而提前給予參麥注射液的大鼠，上述癥狀均有顯著改善，且部分指標具有劑量依賴性。參麥注射液能夠通過減少炎癥反應(yīng)，保護心肌細胞，恢復(fù)心肌功能來拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性。

NF-κB 信號通路是細胞內(nèi)最為重要的炎癥誘導(dǎo)分子通路。使促炎因子TNF-α 和白介素等胞外信號均能引起NF-κB 通路的激活的激活。NF-κB 蛋白是調(diào)控細胞炎癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其P65亞基的磷酸化是NF-κB 激活的標志［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠給予阿霉素72 h 后，心臟組織內(nèi)NF-κB 的磷酸化程度升高，提示NF-κB 信號通路激活。參麥注射液能夠通過降低阿霉素升高的p-NF-κB，阻斷NF-κB 信號通路啟動，減少炎癥的產(chǎn)生，提示參麥注射液的抗炎作用與抑制NF-κB 通路有關(guān)。此外，NF-κB 信號通路的激活對腫瘤的轉(zhuǎn)移具有明顯的促進作用［13］，參麥注射液能抑制阿霉素升高的NFκB 磷酸化，也提示了參麥注射液能夠有效輔助阿霉素治療腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移。

綜上所述，參麥注射液能夠有效的拮抗阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷，且這種保護作用體現(xiàn)在抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌炎癥的產(chǎn)生，保護心肌功能，并調(diào)控NF-κB 信號通路抑制細胞內(nèi)炎癥通路的激活。因此，參麥注射液在臨床上能夠作為阿霉素抗腫瘤的輔助用藥。