馮 原，江 穎，周 穎，劉 銳，謝有科，李健哲，朱 林，林偉楠，宋盛娥，韋露璐

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 南寧530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤放療科，廣西 南寧530011；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院老年病科，廣西 南寧530011；5.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康腫瘤內(nèi)科，廣西 南寧530011；6.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧530011）

肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩大類，其中NSCLC 約占肺癌的85%［1-3］。在全球范圍內(nèi)，肺癌是目前威脅人類生命健康的重大疾病之一，是腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的疾病［4］。我國(guó)肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，并且城市的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于農(nóng)村。由于環(huán)境污染、吸煙、人口基礎(chǔ)龐大等因素，我國(guó)將成為世界第一肺癌大國(guó)［5］。因此，采取積極有效的措施防治肺癌成為當(dāng)務(wù)之急。

氣虛血瘀證是指氣虛運(yùn)血無力，血行瘀滯而表現(xiàn)的癥候［6-7］。常由病久氣虛，漸致瘀血內(nèi)停而引起。臨床常表現(xiàn)為面色淡白或晦滯、身倦乏力、氣少懶言、疼痛如刺、常見于胸脅、痛處不移、拒按、舌淡暗或有紫斑、脈沉澀［8-9］。此外，氣虛血瘀證是晚期非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)重要證型，血液高凝狀態(tài)及免疫功能低下是該證的重要病理基礎(chǔ)［10-11］。目前，中醫(yī)藥已經(jīng)成為肺癌治療的重要組成部分。中醫(yī)藥在諸多方面，如穩(wěn)定瘤灶、延長(zhǎng)生存期、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、減輕放化療毒副作用等均顯示出一定的療效和優(yōu)勢(shì)。因此，依據(jù)中醫(yī)藥的基本理論，針對(duì)氣虛血瘀證采取有效的治療將有可能成為治療肺癌的有效手段。

因此，本研究將考察補(bǔ)肺化瘀湯是否可以抑制氣虛血瘀證小鼠Lewis 肺癌的增殖，并探討補(bǔ)肺化瘀湯的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 補(bǔ)肺化瘀湯的配方主要黨參、黃芪、生地、鱉甲、白花蛇舌草、半枝蓮、生地、赤芍、丹參、莪術(shù)、三棱、川芎、紫苑、前胡、杏仁、甘草組成，藥材購(gòu)于北京同仁堂，并經(jīng)河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科閆國(guó)強(qiáng)主任藥師鑒定為正品，均符合2015年版《中國(guó)藥典》 規(guī)范。

1.2 動(dòng)物及細(xì)胞株 Lewis 肺癌細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。C57BL／6小鼠購(gòu)于北京華阜康科技股份有限公司［生產(chǎn)許可證SCXK（京）2019-0008］，飼養(yǎng)在恒溫、恒濕動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼料、飲水等均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。

1.3 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司（批 號(hào)090817）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（FBS，批 號(hào)0928427）購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào)01234127）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)01923）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號(hào)02427）、胰蛋白酶（Trypsin，1 ∶250，批號(hào)09283）均購(gòu)買于美國(guó)Sigma Chemical 公司；一 抗 caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、βactin 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司（批號(hào)分別 為sc-7272、sc-24528、sc-4239、sc-509、sc-8432）。

1.4 儀器 全自動(dòng)血流變儀購(gòu)自河南世輝醫(yī)療器械有限公司（批號(hào)0124）；Western blot 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀器購(gòu)自Bio-rad 公司（批號(hào)034124）。

2 方法

2.1 補(bǔ)肺化瘀湯有效成分提取 補(bǔ)肺化瘀湯組方為黨參20 g、黃芪15 g、生地10 g、鱉甲10 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、生地10 g、赤芍15 g、丹參10 g、莪術(shù)10 g、三棱10 g、川芎10 g、紫苑10 g、前胡10 g、杏仁10 g、甘草6 g。用蒸餾水煎成補(bǔ)肺化瘀湯藥液，濃縮配制成含生藥量2 g／mL，過濾，分裝，4 ℃保存。

2.2 建立氣虛血瘀證小鼠模型 60只C57BL／6小鼠，5周齡，SPF 級(jí)，雄性，體質(zhì)量20～22 g。隨機(jī)取10只小鼠作為空白對(duì)照組，在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，其余50只參照文獻(xiàn)采用多因素刺激制作氣虛血瘀證模型［8］。高脂高糖飲食，84.5%基礎(chǔ)飼料加入5% 蛋黃粉、0.5% 膽固醇、5% 豬油、5% 蔗糖。睡眠剝奪，采用不可預(yù)知的慢性睡眠剝奪方法進(jìn)行刺激，包括按常相光照（8：00至20：00光照，20：00至8：00黑暗）、反相光照（8：00至20：00黑暗，20：00至8：00光照）、持續(xù)光照及持續(xù)黑暗4個(gè)過程（4個(gè)過程為1個(gè)階段），每個(gè)階段為7 d，連續(xù)重復(fù)6周，在每個(gè)階段中4個(gè)過程隨機(jī)安排，每個(gè)階段對(duì)小鼠進(jìn)行48 h 睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)小鼠進(jìn)入睡眠時(shí)，低電壓刺激促使小鼠保持清醒，使小鼠無法進(jìn)入睡眠狀態(tài)。小鼠分為對(duì)照組、氣虛血瘀組及補(bǔ)肺化瘀湯低、中、高劑量組（0.7、1.4、2.8 g／kg）。按照相當(dāng)于人等效劑量的5倍、10倍、20倍得到補(bǔ)肺化瘀湯低、中、高劑量，灌胃給藥，1次／d，連續(xù)給藥15 d。

實(shí)驗(yàn)期間觀察記錄小鼠行為表現(xiàn)、癥狀體征。實(shí)驗(yàn)期間取血測(cè)定血液流變指標(biāo)，以驗(yàn)證氣虛血瘀證動(dòng)物模型成功。

2.3 建立氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠模型 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis 肺癌細(xì)胞，消化、離心、計(jì)數(shù)后，重懸制 備成濃度為1 × 107／mL 細(xì)胞懸液，0.2 mL／只接種于氣虛血瘀小鼠右后肢皮下。根據(jù)瘤體積，將50只小鼠分成模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組（1 mg／kg 順鉑）及補(bǔ)肺化瘀湯低、中、高劑量組（0.7、1.4、2.8 g／kg），每組10只。按照相當(dāng)于人等效劑量的5倍、10倍、20倍得到補(bǔ)肺化瘀湯低、中、高劑量，灌胃給藥，1次／d；模型組給予等體積生理鹽水灌胃、正常喂養(yǎng)；陽(yáng)性藥對(duì)照組按1 mg／kg 劑量，腹腔注射順鉑，1次／d，連續(xù)給藥15 d。

隔天觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)和精神狀態(tài)等，稱量并記錄小鼠的體質(zhì)量，取各組的平均值，繪制體質(zhì)量變化曲線。游標(biāo)卡尺測(cè)量荷瘤小鼠腫瘤的長(zhǎng)短徑，a 代表腫瘤最短徑，b 代表腫瘤最長(zhǎng)徑，腫瘤體積=1／2×a2×b，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=［（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）／模型組平均瘤重］×100%。剝離各組小鼠的心臟、脾臟、雙肺、腎臟、肝臟等組織稱定質(zhì)量，臟器指數(shù)（mg／g）=臟器重（mg）／體質(zhì)量（g）。

2.4 TUNEL 染色 石蠟切片二甲苯浸洗2次×5 min脫蠟，遞減梯度酒精（100%、95%、90%、85%、70%）水化，3 min／次，PBS 漂 洗2次，5 min／次，滴加新配制蛋白酶K 工作溶液，室溫下靜置15 min，制備TUNEL 反應(yīng)混合液，實(shí)驗(yàn)組用50 μL TdT＋450 μL 熒光素酶標(biāo)記的dUTP 液混勻，取50 μL 混合液加在玻片上，陰性對(duì)照組只加50 μL熒光素酶標(biāo)記的dUTP 液，于暗濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗3次，5 min／次，玻片干后加50 μL converter-POD 于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中37 ℃反應(yīng)30 min，PBS 漂洗3次，5 min／次，在組織處加50 μL DAB 底物，室溫孵育5 min，PBS 漂洗3次，5 min／次，蘇木素復(fù)染3 s后，立即用自來水沖洗，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞并拍照。

2.5 Western blot 取出荷瘤鼠腫瘤組織置于研缽中，液氮條件下用研磨棒研磨，將組織轉(zhuǎn)移至EP管中，加入適量RIPA 裂解液及PMSF 蛋白酶抑制劑，超聲波粉碎30 s，冰上裂解30 min 后，4 ℃12 000 r／min 離心30 min 沉淀組織碎片，取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE 凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉，一抗（1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1 ∶5 000）室溫孵育2 h，ECL 顯色。采用Image J2圖像分析軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（）表示。組間比較采用One-Way ANOVA 分析，多重比較在方差齊性時(shí)用Bonferroni方法，方差不齊性時(shí)用Dunnett T3方法。P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 氣虛血瘀證小鼠模型的建立及表征觀測(cè) 通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法，造模組小鼠出現(xiàn)不同程度的氣虛血瘀證表型，具體表現(xiàn)為倦怠嗜睡，精神萎頓，活動(dòng)性較差，運(yùn)動(dòng)時(shí)間短，體質(zhì)量下降，過勞后氣短喘息，毛發(fā)稀疏且容易脫落，舌質(zhì)顏色暗淡，尾部出現(xiàn)不同程度的皮下瘀紫或青斑；而對(duì)照組小鼠則活動(dòng)靈活，毛色潔白光澤，未見尾部青斑，體質(zhì)量正常，未見其他異常表現(xiàn)。詳細(xì)記錄對(duì)照及模型組小鼠的體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)（游泳）時(shí)間及運(yùn)動(dòng)后的排便量，如表1所示，與對(duì)照組比較，氣虛血瘀模型組小鼠的體質(zhì)量和游泳時(shí)間明顯減少，而游泳后的排便量明顯增加（P＜0.01），表明氣虛血瘀小鼠的氣虛體弱、乏力及便溏癥狀。

表1 氣虛血瘀證小鼠相關(guān)指標(biāo)評(píng)定（）Tab.1 Evaluation of relevant indicators for identification of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern in mice（）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

3.2 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較，氣虛血瘀組的高、中、低切變率，血漿黏度顯著地升高（P＜0.05，P＜0.01），血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、活化的部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、血漿纖維蛋白原（FIB）水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；而補(bǔ)肺化瘀湯組能顯著逆轉(zhuǎn)氣虛血瘀組血液流變學(xué)指標(biāo)（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on hemorheological parameters in mice of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern（， n=10）

表2 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證小鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響（， n=10）Tab.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on hemorheological parameters in mice of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern（， n=10）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與氣虛血瘀組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

3.3 氣虛血瘀Lewis 肺癌小鼠模型的建立 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Lewis 肺癌細(xì)胞懸液接種至氣虛血瘀模型小鼠的右后肢皮下，接種1周后成瘤，見圖1。

圖1 氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠模型的建立Fig.1 Establishment of mouse models with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.4 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)、臟器指數(shù)及體質(zhì)量的影響 補(bǔ)肺化瘀湯組、陽(yáng)性藥對(duì)照組腫瘤體積、腫瘤重均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），且呈濃度依賴性地抑制腫瘤生長(zhǎng)。順鉑陽(yáng)性藥對(duì)照組抑瘤率為59.15%，補(bǔ)肺化瘀湯低劑量為17.98%，補(bǔ)肺化瘀湯中劑量為40.06%，補(bǔ)肺化瘀湯高劑量為51.41%。

觀察發(fā)現(xiàn)各組小鼠均精神狀態(tài)良好，補(bǔ)肺化瘀湯各治療組的體質(zhì)量均與模型組無顯著差異，平穩(wěn)緩慢增長(zhǎng)；而陽(yáng)性藥對(duì)照組小鼠體質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.01），治療結(jié)束時(shí)，小鼠體質(zhì)量輕微下降。補(bǔ)肺化瘀湯組、陽(yáng)性藥對(duì)照組的心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟指數(shù)與模型組比較均無顯著性差異。

圖2 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)、臟器指數(shù)及體質(zhì)量的影響Fig.2 Effects of Bufei Huayu Decoction on tumor growth，organ index and body mass of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.5 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)Lewis 肺癌氣虛血瘀證小鼠腫瘤組織凋亡的影響 如圖3 TUNEL 染色所示，模型組腫瘤細(xì)胞大小不等，表明其增殖迅速，且不穩(wěn)定；而補(bǔ)肺化瘀湯高、中劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組中的腫瘤細(xì)胞脹大，且凋亡細(xì)胞百分比顯著增加。這說明了不同濃度的補(bǔ)肺化瘀湯可以誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生不同程度的凋亡。

圖3 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠組織凋亡的影響Fig.3 Effects of Bufei Huatan Decoction on tissue apoptosis of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

3.6 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織凋亡蛋白的影響 半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是一種胞漿蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［12］。凋亡是caspase 家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過程，其中caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)分子，也是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，被稱為死亡執(zhí)行蛋白酶［13-14］。caspase-9是線粒體凋亡途徑的效應(yīng)蛋白，線粒體凋亡途徑被激活，細(xì)胞質(zhì)中的caspase-9前體發(fā)生剪切，使其活化啟動(dòng)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)［15］。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白Bax，與線粒體膜通透性及線粒體膜電位的維持密切相關(guān)，在線粒體凋亡途徑中扮演著重要角色［15］。如圖4所示，與模型組比較，補(bǔ)肺化瘀湯能顯著促進(jìn)cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax 蛋白表達(dá)（P＜0.01）；抑制Bcl-2蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

圖4 補(bǔ)肺化瘀湯對(duì)氣虛血瘀證Lewis 肺癌小鼠組織凋亡蛋白的影響Fig.4 Effects of Bufei Huayu Decoction on apoptosis protein of mice with Lewis lung cancer of Qi-Deficiency and Blood-Stasis Pattern

4 討論

氣虛血瘀證是臨床諸多疾病常見的中醫(yī)證候之一［6-7］。由于氣虛運(yùn)血無力、血行瘀滯而表現(xiàn)的癥候，常由病久氣虛、漸致瘀血內(nèi)停而引起。此外，氣虛血瘀證是晚期非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)重要證型［16-17］。近年來，隨著生活方式的轉(zhuǎn)變加上工作節(jié)奏的加快，氣虛血瘀證在臨床上多見，并成為非小細(xì)胞肺癌的一個(gè)重要的標(biāo)記及誘因［10-11，18］。非小細(xì)胞肺癌是嚴(yán)重威脅著人類生命健康的惡性腫瘤。目前，臨床上治療非小細(xì)胞肺癌通常使用細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物，但是由于細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物的選擇性較差，常引起危害患者健康的毒副反應(yīng)。因此，尋找新的、高選擇性、無毒副作用的抗腫瘤藥物迫在眉睫。中藥復(fù)方是多成分混合體，作為外源性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體必然對(duì)內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生擾動(dòng)，具有整體性和互助性原則。中醫(yī)認(rèn)為“氣為血帥、血為氣母”“氣行則血行、氣滯則血瘀”，氣血之間相互依存、相互促進(jìn)，在氣虛血瘀型中互為因果，補(bǔ)肺化瘀湯既有補(bǔ)氣的功效，又可活血，對(duì)氣虛血瘀證的高“濃、黏、凝、聚”狀態(tài)有顯著改善，因此補(bǔ)肺化瘀湯將有可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的一種新的治療藥物［9，17，19-21］。

在本研究中，通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激的小鼠出現(xiàn)倦怠嗜睡，精神萎頓，四肢蜷縮，活動(dòng)性較差；毛發(fā)稀疏且易脫落，干燥枯黃且失去原有光澤；大部分小鼠出現(xiàn)了不同程度的腹瀉；尾部出現(xiàn)不同程度的皮下瘀紫或青斑等不同程度的氣虛血瘀證表型。統(tǒng)計(jì)氣虛血瘀小鼠和對(duì)照小鼠的體質(zhì)量、運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)后排便量，發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證小鼠的體質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)時(shí)間均明顯低于對(duì)照小鼠，而運(yùn)動(dòng)后排變量卻顯著增加，這些癥狀分別對(duì)應(yīng)了氣虛血瘀的消瘦、懶動(dòng)和便溏癥狀。于此同時(shí)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀證患者的血液均表現(xiàn)出“濃、黏、凝、聚”等改變，故將凝血指標(biāo)的異常、血液流變學(xué)列為氣虛血瘀證的實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)［17，21-22］。通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法，造模小鼠的高、中、低切變率，血漿黏度顯著地升高，而凝血功能（PT、APTT 和FIB）降低，表現(xiàn)出不同程度的“濃、黏、凝、聚”等氣虛血瘀證表型。灌胃給予不同劑量補(bǔ)肺化瘀湯后，造模小鼠的狀態(tài)隨著藥物濃度的增加逐漸恢復(fù)，精神狀態(tài)良好。此外，補(bǔ)肺化瘀湯呈濃度依賴性地降低造模小鼠的高、中、低切變率，血漿黏度。這表明了，補(bǔ)肺化瘀湯可以有效地逆轉(zhuǎn)通過疲勞、驚恐、高脂飲食等刺激方法引起的小鼠氣虛血瘀證表型。

大量文獻(xiàn)均表明，放、化療是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用的［23-25］。為了考察補(bǔ)肺化瘀湯是否具有抗非小細(xì)胞肺癌的作用，建立了具有氣虛血瘀證的Lewis 肺癌小鼠，并通過TUNEL 染色考察補(bǔ)肺化瘀湯是否可以誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，補(bǔ)肺化瘀湯可以呈濃度依賴性地增加腫瘤組織中TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。此外，細(xì)胞凋亡是caspase 家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過程，即在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的刺激下，啟動(dòng)型的caspases 先被激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)型caspases，大范圍地降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終使細(xì)胞走向死亡［26-28］。蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果均表明，補(bǔ)肺化瘀湯能激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)分子caspase-3。補(bǔ)肺化瘀湯是通過引起Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用的。此外，在凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)caspase 激活主要通過三條途徑：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，這三條途徑都會(huì)激活caspase-3［24，28，30］。其中，線粒體途徑是凋亡的主要途徑，主要表現(xiàn)為線粒體受損，促使Cyto c 釋放到胞漿中，進(jìn)而啟動(dòng)caspase 激活，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生［24-25］。此外，在線粒體凋亡途徑激活中，Bcl-2家族成員扮演著重要的調(diào)節(jié)作用。其中，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，Bax 作為促凋亡蛋白，可拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，兩者的比值決定細(xì)胞走向生存還是死亡的命運(yùn)［29-30］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)肺化瘀湯可以呈濃度依賴地引起小鼠移植瘤組織中促凋亡蛋白Bax 的顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的顯著下降。與此同時(shí)，補(bǔ)肺化瘀湯濃度依賴地引起線粒體凋亡途徑的效應(yīng)蛋白caspase-9的增加。終上所述，補(bǔ)肺化瘀湯促Lewis 肺癌細(xì)胞凋亡作用是通過線路體凋亡途徑得以實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，補(bǔ)肺化瘀湯具有抗氣虛血瘀證小鼠的Lewis 肺癌作用，其機(jī)制是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞通過線粒體凋亡途徑發(fā)生凋亡而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)不僅為補(bǔ)肺化瘀湯抗氣虛血瘀證小鼠的Lewis 肺癌的抗腫瘤機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為補(bǔ)肺化瘀湯早日應(yīng)用于臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供了理論依據(jù)。