張 浩卓詩勤 金蓉蓉王曉艷

［1.臺州市中醫(yī)院，浙江 臺州318000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053；3.鴻運華寧（杭州） 生物醫(yī)藥有限公司，浙江 杭州310053］

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤。非小細胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCC）屬于肺癌的一種，非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%～85%，主要是采用化療方式進行［1-5］。腫瘤細胞具有自我更新、靶向轉(zhuǎn)化等特點，這些特性均與干細胞一樣，腫瘤細胞群中有一小部分細胞能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并具有無限制自我更新、復(fù)制能力、高增殖活性等特性，這一亞群被稱為腫瘤干細胞，其相對應(yīng)的特性被稱為腫瘤干性［6-10］。腫瘤干性的一些表現(xiàn)包括耐藥性、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)化等。靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGF receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）在非小細胞肺癌的治療中廣泛應(yīng)用，一些患者即使初始有效但也逐漸產(chǎn)生獲得性耐藥［11］。耐藥性的產(chǎn)生極大的影響了靶向藥物的應(yīng)用。如何克服EGFR-TKI 耐藥尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物及其機制也是一個重點。

中藥以其活血化瘀、清熱解毒、扶正固本等功效發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。欖香烯（elemene，ELE）是從中藥溫郁金根莖提取的一種非細胞毒性抗腫瘤藥物抗癌有效成分。β-欖香烯的化學名為1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙基環(huán)己烷，是一種新型的抗癌藥，以其獨特的藥理作用被廣泛用于治療肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其它淺表性腫瘤，具有很強殺滅腫瘤細胞及抑制腫瘤生長的作用［14］，β-欖香烯有良好的抗癌作用，且對于調(diào)控干性及干細胞分化甚至對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）也有相關(guān)作用。本實驗通過β-欖香烯單用或與吉非替尼聯(lián)合作用于吉非替尼的耐藥肺癌細胞株的一系列實驗，探討β-欖香烯對肺癌細胞是否有干性方面作用并且對其初步探索。

1 材料

1.1 細胞株 人肺腺癌細胞株P(guān)C9細胞、A549細胞、H522細胞、HCC827細胞、NCI-H1299細胞，均購自 ATCC（American type culture collection），在本實驗室常規(guī)傳代。

1.2 試藥 β-欖香烯購自中國食品藥品檢定研究院，批號100268-201701，含有量≥98%；吉非替尼（Gefitinib）購自杭州啟真湖生物科技有限公司，批 號420019-201702。DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA），購自Hyclone 公司，批號 161112；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，批號 170119；CellTiter 96? Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，購自promega 公司，批號 170111；ZEB1抗體購自CST 公司，批號 170212；N-Cadherin、ECadherin 抗 體，購 自 EPIT＆MICS 公 司，批 號 170322；山羊抗鼠、山羊抗兔熒光二抗，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號170117。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100）；研究級正置顯微鏡（Nikon ECLIPSE 9i）（Nikon）；熒光定量PCR 儀（7500 Real Time PCR System）（BIO-RAD）；細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma371）；生物安全柜（1300SERIES A2）；流式細胞儀（Calibur，美國BD 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 β-欖香烯注射液0.8 g／mL，用DMSO 按1 ∶3稀釋后配成母液保存，此時質(zhì)量濃度為200 mg／mL；吉非替尼母液濃度為200 mmol／L，按照所需體積、分子量及濃度計算所需稱取的吉非替尼粉末，溶于所需體積的DMSO 中即可；β-欖香烯和吉非替尼的濃度是參照文獻選擇，而200 μg／mL是β-欖香烯的凋亡濃度，選取主要的濃度并做等差或等比數(shù)列遞增。

2.2 體外細胞活性檢測（MTS 實驗）取對數(shù)生長期的肺癌PC9、A549、H522、NCI-H1299細胞，每孔1×104個細胞，接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)；24 h后加入各實驗組藥物，每種濃度設(shè)6個復(fù)孔，并設(shè)空白組（不接種細胞）、對照組（只含等量溶劑）；培養(yǎng)24 h 后每孔加入CellTiter 96? Aqueous One Solution Reagent 20 μL，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育1～4 h；在酶標儀上選擇490 nm 波長，測定各孔光吸收值OD，計算細胞活力=［（OD試驗組-OD空白組）／（OD對照組-OD空白組）］×100%。

2.3 細胞遷移檢測 將待檢測的細胞預(yù)先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度達到100%時，用100 μL 的槍頭劃過細胞表面，使平鋪的細胞間出現(xiàn)縫隙，每孔劃3條；棄培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗去懸浮的細胞，用無血清的含藥DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在板上做好標記；取0、6、12、24、36 h 等時間點，用倒置顯微鏡對標記點進行拍照記錄細胞劃痕愈合情況，計數(shù)。

2.4 細胞侵襲檢測 小室中加入50 μg，40 μL Fibronectin，次日吸取多余的液體，并用無菌PBS清洗后棄去并晾干；待檢測細胞用胰酶消化，離心后使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，并加入各實驗組藥物，每個小室5×104個細胞，300 μL 的無血清含藥培養(yǎng)基；小室外使用含有10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)。12～24 h 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，小室用預(yù)冷的甲醇置于-20 ℃固定8 min，1%結(jié)晶紫染色室溫染色20 min，將小室上方的細胞擦拭干凈，割下膜，甘油封片；顯微鏡拍照并計數(shù)。

2.5 細胞凋亡檢測 將待檢測的細胞先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度達到90% 時，將培養(yǎng)液換成不同濃度的含藥的無血清培養(yǎng)基，進行處理，同時設(shè)置陰性陽性對照的細胞；48 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3遍，用胰酶消化，收集細胞，離心棄上清，PBS洗2次，離心棄上清；按Annexin V／PI apoptosis kit 說明處理細胞，加入100 μL 1×bindding buffer重懸細胞，分別加入10 μL 的FITC 和PI，室溫孵育10～15 min 后，每管再加入400 μL 1×bindding buffer，混勻，將其轉(zhuǎn)移至流式管，上流式儀檢測。

2.6 細胞周期檢測 將待檢測的細胞先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度達到80% 時，將培養(yǎng)基換成含有40 μmol／L Gefitinib 的含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行同步化處理；同步化處理24 h 后，將培養(yǎng)液換成不同濃度的含藥的無血清培養(yǎng)基，進行處理；24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3遍，用胰酶消化，收集細胞，離心棄上清，PBS洗1次，離心棄上清；按Cell Cycle Staining Kit 說明書先后加入1 mL Reagent A 和10 μL Reagent B，混勻5～10 s，室溫孵育30 min 后轉(zhuǎn)移至流式管，上流式儀檢測。

2.7 Western blot 取40 μg 蛋白，加入溴酚藍，體積不同的樣品用RIPA 或超純水補齊至相同體積，100 ℃煮沸5 min，取出放冰上。制膠配方見表1。

表1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配方Tab.1 Formulation of SDS-polyacrylamide gel

2.7.1 電泳 起始電壓為80 V，約30 min 后溴酚藍呈一條水平線并進入分離膠，再調(diào)至120 V電壓。

2.7.2 轉(zhuǎn)膜 電泳停止后，將SDS-PAGE 膠取下，進行半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，注意放置順序并趕除氣泡，調(diào)電壓至100 V，轉(zhuǎn)膜時間由蛋白大小決定，一般在60～90 min。

2.7.3 封閉 將轉(zhuǎn)好的膜取出，正面朝上，用5%的牛奶進行封閉，室溫約2～4 h。

2.7.4 一抗孵育 按抗體說明書要求用5% 牛奶稀釋抗體，將膜置于稀釋的抗體中，搖床4 ℃過夜。

2.7.5 二抗孵育 將一抗回收，加入適量TBST洗液，水平搖床洗滌5 min，反復(fù)3次，用5%牛奶稀釋二抗，將膜置于稀釋的抗體中，室溫孵育2～3 h。

2.7.6 ECL 顯色 加入適量TBST 洗液，水平搖床洗滌3次，5 min／次，取ECL 發(fā)光試劑A 和B按1 ∶1的比例混勻后，加至膜上，約等待1 min，在暗室曝光顯影。

2.8 統(tǒng)計學分析 所有實驗結(jié)果均是由獨立的3次重復(fù)試驗得到，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以（）表示，組間比較用t檢驗，多組比較用one-way AVONA 檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞活性的影響 如圖1所示，與對照組比較，除50 μg／mL β-欖香烯對肺癌細胞H1299細胞活性無影響外，β-欖香烯顯著抑制肺癌細胞株（A549、H1299、H522、PC9）細胞活性（P＜0.05，P＜0.01），細胞增殖抑制。β-欖香烯濃度在0～50 μmol／L 內(nèi)對肺癌細胞活性無顯著影響。

圖1 β-欖香烯對肺癌細胞活性的影響Fig.1 Effects of β-elemene on the activity of lung cancer cells

已有研究表明，A549細胞和H1299細胞對吉非替尼具有耐藥性，后續(xù)實驗采用A549細胞。單用吉非替尼隨著其濃度的增加A549細胞活性逐漸下降；不同濃度吉非替尼聯(lián)合40 μg／mL β-欖香烯作用時，A549細胞活性也逐漸下降，且較單用吉非替尼更能抑制細胞活性；與對照組比較，40 μg／mL β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼（5、10 μmol／L）能顯著抑制A549細胞活性（P＜0.05），見圖2。因此，后續(xù)實驗選用5 μmol／L 吉非替尼和40 μg／mL β-欖香烯進行。

3.2 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞凋亡、周期的影響 如圖3所示，β-欖香烯、吉非替尼、β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對A548細胞凋亡沒有明顯影響；而β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼作用時，S 期細胞比例降低（P＜0.05）。

3.3 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響 如圖4所示，β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細胞12 h 后，A549細胞侵襲能力顯著抑制（P＜0.01）；β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細胞12、24、36 h 后，A549細胞轉(zhuǎn)移能力顯著抑制（P＜0.05）。

圖2 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對A549細胞活性的影響Fig.2 Effects of β-elemene combined with gefitinib on the activity of A549 cells

3.4 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼作用抑制肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithlial-Mesenchymal Transition，EMT）神經(jīng)-鈣粘連蛋白（N-Cadherin）、轉(zhuǎn)錄因子（ZEB1），波動蛋白（Vimentin）是間質(zhì)化細胞的標記，上皮樣細胞的標志物為上皮-鈣粘蛋白（E-Cadherin）。與對照組比較，β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細胞，E-Cadherin 蛋白表達顯著上調(diào)，N-Cadherin、ZEB1、Vimentin 蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖6。

4 討論

圖3 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞凋亡、周期的影響Fig.3 Effects of β-elemene combined with gefitinib on apoptosis and cell cycle of lung cancer cells

圖4 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 Effects of β-elemene combined with gefitinib on invasion and metastasis of lung cancer cells

圖5 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effects of β-elemene combined with gefitinib on epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells

綜上結(jié)果，β-欖香烯與吉非替尼合用能夠抑制肺癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移，抑制EMT 過程，對肺癌細胞的腫瘤干性有明顯的作用。ZEB1與抑制干性的基因相關(guān)且在胰腺癌細胞中得到證實，與胰腺癌干細胞相關(guān)［15-16］。因此找尋通過調(diào)控干性從而逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性的分子，可能為抗腫瘤治療提供1個新靶點，為化療提供輔助藥物，為中藥應(yīng)用拓寬道路。

欖香烯為我國自行研制的國家二類非細胞毒性抗腫瘤藥，它是從姜科植物溫郁金中提取的萜烯類化合物的混合物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，其中的主要成分為β-欖香烯。目前臨床上廣泛應(yīng)用于惡性漿膜腔積液、消化道腫瘤、腦瘤、肺癌及一些淺表性腫瘤的治療。高濃度β-欖香烯通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來抗腫瘤，有報道稱低濃度的β-欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。最近的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力較其他細胞強，且經(jīng)化療后促進了腫瘤細胞的EMT 過程，產(chǎn)生一些EMT 標志性基因的變化。由此可見，耐藥性和EMT 之間可能存在某種聯(lián)系?？鼓[瘤目前的研究熱點在腫瘤干細胞上，側(cè)重于對腫瘤干細胞的相關(guān)特性進行研究，更加深入的探索相關(guān)的機制。