呂彥霖，朱昌毫，潘耀振，陳 玲，喻 超，孫誠誼

（貴州醫(yī)科大學(xué)附院肝膽外科，貴州 貴陽550004）

近些年來，膽管癌已經(jīng)成為南美和亞洲第二常見的原發(fā)性肝癌，且早期難以診斷，大多數(shù)患者診斷時已為晚期［1］。盡管隨著科技的發(fā)展，對于膽管癌的治療有了很多先進(jìn)的方法，比如手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)藥物治療等，但是在晚期患者中總體預(yù)后較差，5年生存率僅為20%～30%［2］。最近研究表明，中國傳統(tǒng)中藥對包括膽管癌在內(nèi)的多種癌癥都有治療作用［3-4］。

青藤 堿（7，8-didehydro-4-hydroxy3，7-dimethoxy-17-methyl-9a，13a，14a-morphinan-6-one，SIN）是一種從中草藥青藤中提煉出來的活性成分，在中國已經(jīng)有兩千多年用治風(fēng)濕病的歷史［5］。近年來隨著對青藤堿的深入研究，發(fā)現(xiàn)青藤堿不僅在治療免疫相關(guān)疾病時具有抗炎［6］、鎮(zhèn)痛［7］、免疫抑制和抗血管生成［8］以及改善關(guān)節(jié)炎等作用，而且其抗腫瘤作用也尤為顯著。近年來，許多研究人員做了大量關(guān)于青藤堿在抗腫瘤方面的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)青藤堿對胃癌［9］、肝癌［10］、卵巢癌［11］以及胰腺癌［12］等多種腫瘤具有明顯的抑制作用。然而，青藤堿是否對膽管癌也具有相同的抑制作用，相關(guān)的研究目前還比較少。

本研究通過研究青藤堿對人類膽管癌細(xì)胞系HUCCT-1及TFK-1生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用，探討青藤堿對膽管癌的治療作用，為開發(fā)和尋找新型抗膽管癌藥物做積極探索。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 HuCCT-1、TFK-1膽管癌細(xì)胞株購自湖北省武漢市同濟(jì)醫(yī)院肝膽胰外科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試藥 青藤堿（Selleck，批號S235901），胎牛血清（Gibco，批 號 1992275）、RPMI-1640（Gibco，批 號 22400105）、0.25% 胰蛋白酶（Gibco，批號25200056）、0.05%不含EDTA 的胰蛋白酶（Gibco，批號15400054），Cell Counting kit-8（CCK-8）（碧云天，批號C0037），Transwell小室（Corning，批號3422），Matrigel 膠（BD，批號354234）、AV-FITC／PI 凋亡試劑盒（Solabio，批號CA1020），RIPA 裂解緩沖液（Solabio，批號R0020），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Solabio，批號 PC0020）、SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒（Millipore，批 號 V900858 ），Cleaved-Caspase3（CST，批號9661S）、Cleaved-Caspase9（CST，批號9502S）、Vimentin（CST，批號5741S）、E-cadherin（CST，批號3195S）、GAPDH（CST，批號5174S），羊抗鼠（Boster Bio，批號BM2002）、羊抗兔（Boster Bio，批號BA1066）。

1.3 青藤堿溶液的配制 青藤堿首先溶于二甲基亞砜DMSO 溶液溶解，配制終濃度為50 mmol／L 的儲存液，放進(jìn)4 ℃冰箱低溫避光存放。需使用時，采用無血清RPMI-1640將貯備液稀釋為10 mmol／L的工作液用以加藥處理細(xì)胞。使每組培養(yǎng)基中含有DMSO 的濃度為0.1%，來表明DMSO 對膽管癌細(xì)胞無毒性。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 2種人類膽管癌細(xì)胞株HuCCT-1、TFK-1均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中進(jìn)行孵育培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%～80%后用胰蛋白酶進(jìn)行消化后傳代處理，后續(xù)試驗(yàn)選取處于對數(shù)生長期細(xì)胞。

2.2 CCK-8檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS 清洗，0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%血清的培養(yǎng)基中和，制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，接種4 000個細(xì)胞于96孔板每孔中，每個孔用培養(yǎng)基配足200 μL 體積。實(shí)驗(yàn)分組分為6組，空白對照組（用不含青藤堿的1640處理）、0.125 mmol／L 青藤堿組、0.25 mmol／L 青藤堿組、0.5 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、2.0 mmol／L 青藤堿組，每組5個生物學(xué)重復(fù)，培養(yǎng)24 h 后按照分組進(jìn)行加藥處理，處理完畢后封閉蓋子，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況，各組給予不用濃度的青藤堿處理24、48、72 h 后，分別棄去96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，向每孔中加入110 μL CCK-8顯色液（10 μL CCK-8溶于100 μL 無血清培養(yǎng)基）。加液完畢后將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育，每隔1 h 用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的OD 值，測量3次；最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，匯總分析并作圖。其公式為細(xì)胞存活率=［（空白對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）／對照組OD值］×100%。

2.3 克隆平板檢測長期細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基中和后得到細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，接種4 000個細(xì)胞于六孔板每孔中進(jìn)行培養(yǎng)，需要反復(fù)吹打混勻，防止細(xì)胞抱團(tuán)生長。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為4組，空白對照組（用不含青藤堿的1640處理）、0.5 mmol／L 青藤堿組、1.0 mmol／L 青藤堿組、2.0 mmol／L 青藤堿組，每組6個生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行加藥處理。各孔中青藤堿和RPMI-1640培養(yǎng)基總體積配足3.5 mL，放入無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14 d 后終止培養(yǎng)，用PBS 漂洗細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結(jié)晶紫染色30 min，最后使用PBS 清洗數(shù)遍后放入烘箱，烘干進(jìn)行拍照處理并統(tǒng)計分析克隆形成數(shù)量。

2.4 Annexin V／PI 雙染色檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)期生長膽管癌細(xì)胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基中和后得到細(xì)胞懸液。顯微鏡下計數(shù)后按每孔接種5 ×104個膽管癌細(xì)胞均勻接種于六孔板中。后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，細(xì)胞分組同“2.3”項(xiàng)下。按照分組加入不同濃度的青藤堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞。將六孔板內(nèi)各孔上清液收集于15 mL 離心管，PBS 清洗后收集于15 mL 離心管內(nèi)，再使用1.0 mL 不含EDTA 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，2.0 mL含血清培養(yǎng)基中和后收集于15 mL 離心管，后再用PBS 清洗一遍六孔板，各收集于相應(yīng)15 mL 離心管內(nèi)，設(shè)置離心機(jī)1 200 r／min，離心5 min，棄上清。后加入3 mL PBS 于15 mL 離心管，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于流式管內(nèi)，繼續(xù)離心，1 200 r／min，離心5 min，以清洗細(xì)胞。棄上清后，每管加入500 μL 1×Binding buffer、懸浮細(xì)胞數(shù)目為1 ×106／mL，再加入5 μL 的AnnexinV FITC 染液和10 μL PI 染色液，輕輕吹打均勻后，4 ℃避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，分析記錄結(jié)果。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)期生長膽管癌細(xì)胞，PBS 清洗，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基中和后得到細(xì)胞懸液。顯微鏡下計數(shù)后按每孔接種2×106個膽管癌細(xì)胞均勻接種于六孔板中。后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為4組，分組情況同“2.3”項(xiàng)下，每組設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。使用200 μL 無菌槍頭在六孔板底部細(xì)胞層上劃痕，力度和角度一致，使各條劃痕粗細(xì)均勻。后用PBS 清洗兩次將劃痕脫落的細(xì)胞清洗干凈，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基后，使用倒置相差顯微鏡觀察劃痕的寬度并拍照，計算并記錄0 h 劃痕面積。后按照分組按照各組所設(shè)濃度加入青藤堿。放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h后，再次使用倒置相差顯微鏡拍照并計算劃痕面積，最后根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計算細(xì)胞遷移率（%）。細(xì)胞遷移率=［（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）／0 h劃痕面積］×100%。

2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按照1 ∶5的比例稀釋后，取50 μL 均勻地涂覆到Transwell 上室的底部，將Transwell 小室放入24孔板中，室溫通風(fēng)過夜使之形成凝膠狀。取對數(shù)期生長膽管癌細(xì)胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基中和后得到細(xì)胞懸液。顯微鏡下計數(shù)后按每孔接種2×104個膽管癌細(xì)胞均勻接種于上室中，使用無血清培養(yǎng)基配足200 μL 體積。下室加入660 μL 含10%FBS 的1640培養(yǎng)基后，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組，將細(xì)胞分為4組，分組情況同“2.3”項(xiàng)下，每組設(shè)置3個生物學(xué)副孔，按照分組情況進(jìn)行加藥處理，后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，用PBS 漂洗細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結(jié)晶紫染色30 min，最后使用PBS 清洗數(shù)遍后放入烘箱，烘干進(jìn)行拍照處理并計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.7 Western blot 檢測凋亡及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)取對數(shù)期生長膽管癌細(xì)胞，PBS 清洗，0.25%胰酶消化，用含10%血清的培養(yǎng)基中和后得到細(xì)胞懸液。顯微鏡計數(shù)后接種5×105個細(xì)胞于六孔板每孔內(nèi)，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，對細(xì)胞進(jìn)行分組，分組情況同“2.3”項(xiàng)下，按照分組對細(xì)胞進(jìn)行加藥處理。藥物處理24 h 后，收集細(xì)胞干粉。使用RIPA 裂解液在4 ℃環(huán)境下提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA 蛋白測定濃度試劑盒測定蛋白濃度，按照蛋白上清液：5×Loading Buffer=4 ∶1的比例加入5×loading buffer，95 ℃煮10 min。取每孔泳道20 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，90 V，2 h。后恒流300 mA 電轉(zhuǎn)2 h 轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 9、E-cadherin、Vimentin 等一抗于4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜3次15 min／次。加入二抗室溫孵育2 h，TBST 再洗膜3次，15 min／次，最后使用ECL 發(fā)光液曝光顯色，灰度值分析使用ImageJ 1.45 s 軟件。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青藤堿抑制膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人類膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1經(jīng)過青藤堿處理后，2種膽管癌細(xì)胞生存率均明顯降低，且隨著藥物濃度增大以及藥物作用時間的延長，抑制作用逐漸加強(qiáng)，呈劑量和時間依賴性。除青藤堿0.125 mmol／L，24 h 這組外，與空白對照組比較，青藤堿能顯著抑制HuCCT-1、TFK-1細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。此外，克隆平板表明青藤堿對于膽管癌細(xì)胞的長期增殖具有明顯抑制作用，且抑制效果與藥物濃度呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。表明青藤堿可以抑制膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1增殖。

圖1 不同濃度的青藤堿對膽管癌細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of sinomenine on celluar viability of cholangiocarcinoma

圖2 不同濃度的青藤堿對膽管癌細(xì)胞長期增殖能力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of sinomenine on long-term cellular proliferation of cholangiocarcinoma

3.2 青藤堿促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1凋亡 流式細(xì)胞數(shù)表明，隨著青藤堿藥物濃度的提升，膽管癌細(xì)胞凋亡率明顯增加，且呈劑量依賴性（P＜0.01），見圖3～4。與空白對照組比較，青藤堿顯著促進(jìn)凋亡關(guān)鍵蛋白 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），見圖5～6。表明青藤堿可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1凋亡。

圖3 不同濃度青藤堿對HuCCT-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of different concentrations of sinomenine on apoptosis of HuCCT-1 cells

圖4 不同濃度青藤堿對TFK-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of different concentrations of sinomenine on apoptosis of TFK-1 cells

圖5 不同濃度青藤堿對HuCCT-1 Cleaved caspase 3、Cleaved casepase 9蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 proteins in HuCCT-1 cells

圖6 不同濃度青藤堿對TFK-1 Cleaved caspase 3、Cleaved casepase 9蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 proteins in TFK-1 cells

3.3 青藤堿抑制膽管癌細(xì)胞系HuCCT-1、TFK-1侵襲遷移 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著青藤堿濃度的遞增，膽管癌細(xì)胞穿過鋪有Matrigel 膠小室的細(xì)胞數(shù)目也相應(yīng)減少，膽管癌細(xì)胞的侵襲率逐漸下降，且結(jié)果呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖7。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，青藤堿組劃痕寬度增寬，細(xì)胞遷移率顯著下降，細(xì)胞遷移能力越來越慢，呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖8。此外，上皮-間葉轉(zhuǎn)化（EMT）為惡性腫瘤浸潤的機(jī)制，E-cadherin、vimentin 為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物的表達(dá)，與空白對照組比較，青藤堿以劑量依賴的方式顯著升高E-cadherin、且降低vimentin 蛋白表達(dá)（P＜0.05），見圖9～10。

圖7 不同濃度青藤堿對膽管癌侵襲能力的影響Fig.7 Effects of different concentrations of sinomenine on invasion ability of cholangiocarcinoma

圖8 不同濃度的青藤堿對膽管癌細(xì)胞遷移能力的影響Fig.8 Effects of sinomenine on invasion of cholangiocarcinoma

圖9 不同濃度青藤堿對HuCCT-1 Vimentin、E-Cadherin 蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of Vimentin and E-Cadherin proteins in HuCCT-1 cells

圖10 不同濃度青藤堿對TFK-1 Vimentin、E-Cadherin 蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Effects of sinomenine at different concentrations on the expressions of Vimentin and E-Cadherin proteins in TFK-1 cells

4 討論

膽管癌早期診斷困難，是以高發(fā)病率和高死亡率為特征的肝膽腫瘤。目前針對膽管癌的治療取得了很大進(jìn)展，但是患者的5年生存率依舊很低［13］?，F(xiàn)臨床上應(yīng)用的許多抗腫瘤藥物不僅價格昂貴且不良反應(yīng)較多［14］。因此，尋找一種新的、廉價的、不良反應(yīng)較小的抗腫瘤藥物，從而提高患者的生活質(zhì)量是非常必要且緊要的。據(jù)報道，青藤堿可以在體內(nèi)體外發(fā)揮良好的抗腫瘤作用，且不良反應(yīng)較?。?5］。本次實(shí)驗(yàn)，研究了青藤堿作用于膽管癌之后產(chǎn)生的抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)以人類膽管癌細(xì)胞為研究對象，采用一系列體外實(shí)驗(yàn)研究青藤堿對膽管癌的抗腫瘤作用。CCK-8與克隆平板實(shí)驗(yàn)表明，青藤堿對膽管癌細(xì)胞的存活及增殖能力有明顯的抑制作用，且成時間和劑量依賴性。Annexin V／PI 雙染色法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡，且該凋亡作用呈劑量依賴性。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膽管癌細(xì)胞的侵襲能力隨著青藤堿濃度的升高逐漸降低。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株膽管癌細(xì)胞在相同的時間內(nèi)的遷移距離明顯受到青藤堿濃度的影響，2 mmol／L 濃度的青藤堿基本上使膽管癌細(xì)胞喪失遷移能力。

細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡在消除突變和惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用［16］。已知多種中藥可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來達(dá)到抑制腫瘤生長的目的［17-19］。Annexin V／PI雙染色法表明，青藤堿以劑量依賴性地促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡。caspases 家族可以調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細(xì)胞凋亡、分化、炎癥等。其中caspase-3、caspase-9又歸為促凋亡caspases。caspase-3如今視為細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，而caspase-9被歸類為凋亡效應(yīng)者?；罨腸aspase-9（cleaved-caspase-9）可以進(jìn)一步激活caspase-3，而活化的casepase-3（cleaved-caspase-3）的作用主要是催化多聚（ADP-核糖）聚合酶裂解，該酶與DNA 修復(fù)和基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［20-21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青藤堿可能通過促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡以達(dá)到其抗腫瘤作用。

腫瘤轉(zhuǎn)移全身往往是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。眾所周知，EMT 在腫瘤轉(zhuǎn)移方面起著決定性的作用，是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的主要因素［22］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT 時，上皮標(biāo)志物，如E-cadherin表達(dá)量下降；而間質(zhì)標(biāo)志物，如波形蛋白vimentin表達(dá)量上升［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青藤堿可能通過逆轉(zhuǎn)膽管癌細(xì)胞EMT 來達(dá)到抑制膽管癌細(xì)胞侵襲和遷移的目的。

總而言之，青藤堿可以升高cleaved caspase 3、cleaved caspase 9和E-cadherin 以及降低vimentin 蛋白的表達(dá)水平，有效地抑制膽管癌細(xì)胞增殖，侵襲遷移并促進(jìn)凋亡。研究表明青藤堿對膽管癌具有明顯的抗腫瘤作用，可能為膽管癌的臨床治療提供新的視角。但是若要實(shí)現(xiàn)青藤堿的臨床用藥，還需更多的臨床試驗(yàn)對青藤堿做出進(jìn)一步研究。