邵曉婷，張 瑜，郭擇鄰，賈海燕，韓 光?

（1.河南大學藥學院，河南 開封475000；2.河南省醫(yī)藥技師學院，河南 開封475000）

穿心蓮二萜內(nèi)酯有效部位是課題組前期利用超分子體形成原理從穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.中提取得到，其中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯，14-去氧穿心蓮內(nèi)酯等成分含有量高達80%以上［1］，該部位具有顯著的抗腫瘤作用，可通過細胞毒作用、誘導腫瘤細胞凋亡等途徑來發(fā)揮［2-6］，但其水溶性差，生物利用度低［7］。構(gòu)建納米給藥系統(tǒng)除了能提高難溶性藥物溶解性，保護藥物免于體內(nèi)降解之外，還可延長游離藥物循環(huán)時間［8-9］，如盛歡歡等［10-12］利用冷卻高壓均質(zhì)法制備穿心蓮總內(nèi)酯固體脂質(zhì)納米粒，其粒徑均一，包封率大于80%；劉笑［13］制備聚乙二醇-聚乳酸-穿心蓮內(nèi)酯膠束，載藥量為27.15%，抗腫瘤作用顯著，可大大增強穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)生物利用度和臨床療效。

傳統(tǒng)納米給藥系統(tǒng)以包載單一藥物為主，隨著近年來臨床聯(lián)合用藥不斷增多，有學者提出同時包載多種藥物的新策略［14］，Song 等［15］制備了同時載有硫酸長春堿、鹽酸戊脈定的聚乳酸-聚乙烯醇納米粒，能顯著增強硫酸長春堿對乳腺癌耐藥株細胞的毒性，并增加穩(wěn)定性［16］。中藥有效部位是結(jié)構(gòu)相似的一類或幾類成分按特定比例組成的集合體，與納米載體中同時載有的多種化學藥物相比，其結(jié)構(gòu)類型相近，更有利于多藥載藥納米系統(tǒng)的構(gòu)建。

透明質(zhì)酸是一種天然存在的糖胺聚糖，具有無毒［17］、靶向性、生物可降解性［18］等性質(zhì)，被廣泛用作生物材料［19-20］。用間氨基苯硼酸對透明質(zhì)酸進行化學修飾后，可得到透明質(zhì)酸-苯硼酸衍生物，并且間氨基苯硼酸可與含1，2-或1，3-二醇結(jié)構(gòu)類物質(zhì)結(jié)合而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由于穿心蓮二萜內(nèi)酯有效部位中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯等均具有該結(jié)構(gòu)，故可實現(xiàn)載藥［21］?；谠撛?，本實驗合成透明質(zhì)酸-苯硼酸，構(gòu)建載有穿心蓮二萜內(nèi)酯有效部位的多藥載藥納米粒，并考察其體外抗腫瘤作用和藥動學行為，對改善該部位溶解度，提高其生物利用度具有重要意義。

1 材料

透明質(zhì)酸鈉（分子量21 kDa，華熙福瑞達生物醫(yī)學有限公司，批號1605246）；間氨基苯硼酸（上海薩恩化學技術(shù)有限公司，批號DH110078）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（上海達瑞精細化學品有限公司，批號20151101）；1-羥基苯并三氮唑（上海達瑞精細化學品有限公司，批號20160820）。穿心蓮內(nèi)酯對照品（含有量≥99%，成都天臺山制藥有限公司，批號100804）；脫水穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯對照品（河南大學藥物研究所，IR、UV、MS、1HNMR 確認結(jié)構(gòu)，含有量均≥98.0%，批 號110854）；穿心蓮有效部位（河南大學藥物研究所制備，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯含有量分別為 45.68%、8.58%、10.07%，批號160320）；G-25交聯(lián)葡聚糖（上海源葉生物科技有限公司）。

微孔濾膜（0.22、0.45 μm，美國Amerritech Scientific 公司）；RPMI-1640／DMEM 培養(yǎng)基（美國Life Technologies 公司）；青鏈霉素混合液（100×）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（含有量≥99.9%）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高效RIPA 組織／細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；Gibco 胎牛血清（美國Thermo Fisher Scinetific 公司）；BI 胎牛血清（美國Biological Industries 公司）；四甲基偶氮唑鹽（美國Amresco 公司）。

AVANCE III HD 400 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker BioSpin 公司）；VERTE 70傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker Optics 公司）；超高效液相色譜-質(zhì)譜儀（配置ACQUITY UPLC 超高效液相系統(tǒng)、Xevo? TQD 三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司）；Alpha 1-4LSCphs 冷凍干燥機（德國Christ公司）；Nano-ZS90激光粒度、Zeta 電位分析儀（英國Malvern 公司）；LC-20AT 高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；JEM-2100透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）；Bruker D8 Advance X 射線粉末衍射儀（德國Bruker 公司）；XD-100倒置光學顯微鏡（上海蔡康光學儀器廠）；TGL-16G 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TDZ5-WS 臺式自動平衡離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)公司）；ELX-800酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；高速低溫離心機（美國Thermo 公司）；PH-S-3C PH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；ZWY-2012C 恒溫振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）。

SD 雄性大鼠（SPF 級），體質(zhì)量（200±20）g，動物生產(chǎn)許可證編號SCXK（魯）2014-0007，合格證號004634，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

HepG2人肝癌細胞、MCF-7人乳腺癌細胞由河南大學天然藥物與免疫工程重點實驗室饋贈；A549人肺癌細胞由中國科學院饋贈。

2 方法與結(jié)果

2.1 透明質(zhì)酸-苯硼酸合成與表征 稱取透明質(zhì)酸0.20 g（0.50 mmol）溶于25 mL 純水中，加入氯化鈉0.292 g（5.00 mmol）溶解后逐滴加入33 mL乙醇，再加入間氨基苯硼酸0.056 g（0.41 mmol）、1-羥基苯丙三唑0.02 g（0.15 mmol），1 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至4.75，繼續(xù)加入碳二亞胺鹽酸鹽0.03 g（0.15 mmol），調(diào)節(jié)pH 至4.75，室溫下攪拌反應(yīng)4 h 至pH 不再變化，1 mol／L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至7.5，終止反應(yīng)。反應(yīng)液倒入截留相對分子質(zhì)量8 000～14 000的透析袋中，純水中透析72 h，冷凍干燥，即得白色固體狀本品。合成路線見圖1。

圖1 透明質(zhì)酸-苯硼酸合成路線Fig.1 Synthesis route of hyaluronic acid-phenylboronic acid

透明質(zhì)酸-苯硼酸結(jié)構(gòu)由核磁共振氫譜（1HNMR）確證，以氘代水或氘代二甲基亞砜為溶劑，氘代試劑溶劑峰為參比進行分析。其中，δ1.88歸屬于透明質(zhì)酸的-CH3質(zhì)子峰，δ4.40、3.13～3.98歸屬于透明質(zhì)酸的-CH 或CH2質(zhì)子峰，δ2.50歸屬于間氨基苯硼酸的-NH2質(zhì)子峰，δ6.50～8.00歸屬于苯環(huán)上氫的信號峰，表明該化合物合成成功。

2.2 含有量測定

2.2.1 供試品溶液制備 將納米粒溶液全部轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，純化水定容，搖勻。取1 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲使藥物溶出，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品24.99、2.71、2.73 mg，甲醇溶解后定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度分別為499.8、54.2、54.6 μg／mL）。

2.2.3 色譜條件 Thermo C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，5 μm）；流動相乙腈-水，梯度洗脫（0 min，10 ∶90；50 min，60 ∶40；65 min，10 ∶90）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長205 nm；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.2.4 專屬性試驗 取對照品、納米粒、透明質(zhì)酸-苯硼酸空白溶液各10 μL，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯保留時間分別為24.9、35.2、35.9 min，分離度分別為2.776、1.613、2.378，峰形理想，表明該方法專屬性良好。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取對照品溶液0.25、0.5、1、2、3、4、5 mL 于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得到穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯方程分別為Y=19 515X＋106 149（R2=0.999 7）、Y=22 075X＋31 674（R2=0.999 4）、Y=37 093X-16 567（R2=0.999 5），分別在24.99～499.80、2.71～54.20、2.73～54.60 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限分別為6.25、5.03、3.77 μg／mL。

2.2.6 加樣回收率試驗 配制低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯平均加樣回收率分別為101.28%、100.07%、101.93%，RSD 分別為0.8%、0.76%、0.50%。

2.2.7 精密度試驗 取199.92、21.68、21.84 μg／mL對照品溶液，同1 d 內(nèi)在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定6次，連續(xù)5 d，測得穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積RSD 均小于5%，表明該方法精密度良好。

2.2.8 包封率、載藥量測定 將納米粒溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，純化水定容，搖勻，取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇超聲后定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜過濾，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，以穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量濃度之和作為藥物質(zhì)量濃度，按下式計算包封率和載藥量，測得兩者分別為（43.2±0.05）%、（90.1±1.60）%。

包封率=We／Wm×100%，載藥量=We／W0×100%。其中，We為納米粒中藥物質(zhì)量，Wm為納米粒總質(zhì)量，W0為投藥量。

2.3 納米粒制備與表征 稱取透明質(zhì)酸-苯硼酸14 mg，加入15 mL 純化水，400 r／min 攪拌溶解。另稱取穿心蓮二萜內(nèi)酯有效部位12 mg，加入1 mL丙酮超聲溶解，逐滴加到透明質(zhì)酸-苯硼酸溶液中，邊滴加邊攪拌，持續(xù)12 h，0.45 μm 微孔濾膜過濾以除去大顆粒物質(zhì)，G-25交聯(lián)葡聚糖填充的凝膠色譜柱分離，除去游離藥物，即得納米粒。

動態(tài)光散射法測定納米粒平均粒徑為（112.3±0.92）nm，PDI 為（0.119±0.03），Zeta 電位為-48.4 mV，結(jié)果見圖2，可知納米粒溶液粒徑較小，分布集中，并具有較高的Zeta 電位。另外取少量納米粒溶液滴加在碳膜銅網(wǎng)上，自然揮干，置于不同倍數(shù)下透射電子顯微鏡下觀察粒子形態(tài)，發(fā)現(xiàn)粒徑均一，分散性良好，大多數(shù)呈球形分布，見圖3。納米粒溶液在室溫下于第1、7、21、30天測定其粒徑及其分布，見圖4，可知30 d 內(nèi)其粒徑和含藥量無明顯變化，溶液澄清透明，無絮凝現(xiàn)象，表明穩(wěn)定性良好。

圖2 納米粒粒徑（A）和Zeta 電位（B）Fig.2 Particle sizes（A）and Zeta potentials（B）of nanoparticles

2.4 增溶效果考察 過量原料藥加適量純化水超聲15 min，以使藥物與水充分接觸并溶解，25 ℃、120 r／min 下恒溫振蕩12 h，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，原料藥過飽和溶液、納米溶液中穿心蓮內(nèi)酯、14-去氧穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯總質(zhì)量濃度分別為103.35、628.60 μg／mL，即制備成納米粒后溶解度增加了約6.2倍，可達到增溶效果。

圖3 納米粒透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope image for nanoparticles

圖4 納米粒貯存穩(wěn)定性Fig.4 Storage stability of nanoparticles

2.5 納米粒體外釋藥考察 取納米粒、原料藥溶液各2 mL 置于透析袋（3.5 kDa）中，放到含60 mL 0.1% SDS 的生理鹽水中，37 ℃、120 r／min下振蕩后于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 各取樣2 mL，同時補加同溫度同體積釋放介質(zhì)，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，計算累積釋放度Er，公式為（Ve為每次取樣體積，V0為釋放介質(zhì)體積，Ci為第i次取樣時藥物質(zhì)量濃度，m為納米粒中含藥量，n為取樣次數(shù)），繪制曲線，見圖5，可知原料藥、納米粒溶液均存在一定的突釋行為，但前者釋放更完全，可能是由于透明質(zhì)酸水溶性較大導致其親水性較強，使得藥物容易向外水相擴散。

圖5 樣品體外釋藥曲線Fig.5 In vitro drug release curves for samples

另外，納米粒溶液在1 h 內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯釋放量分別為69.1%、69.2%，釋放8 h時分別升至89.1%、87.8%，之后趨于穩(wěn)定；原料藥溶液在1 h 內(nèi)兩者釋放量分別為58.3%、49.7%，釋放8 h 時分別升至82.6%、81.1%，之后無明顯變化。由此可知，與原料藥比較，納米粒釋放更完全，24 h 內(nèi)累積釋放度約為90%。

2.6 細胞毒性試驗 采用MTT 法檢測。待培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞匯合率達到80%～90%時，收集細胞并用培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后稀釋成所需密度的細胞懸液，接種于96孔板中（100 μL／孔），分為對照組、加藥組、空白組。培養(yǎng)12 h 后，對照組加入100 μL 完全培養(yǎng)基，加藥組分別加入等體積完全培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度藥物，空白組加入等體積PBS 緩沖液，每組設(shè)3個復孔，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48、72 h后離心，棄上清，每孔加入0.5 mg／mL MTT 溶液100 μL，混勻，放 入細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，2 500 r／min離心5 min，棄去多余MTT 溶液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩使生成的藍紫色結(jié)晶充分溶解，在570 nm 波長下測定光密度（OD）值，計算細胞存活率，公式為細胞存活率=［OD加藥組-OD空白組／OD對照組-OD空白組］×100%，結(jié)果見表1～2。

由表可知，隨著空白納米粒質(zhì)量濃度升高、作用時間延長，HepG2、A549、MCF-7細胞存活率無明顯變化，表明載體材料具有較好的生物相容性；納米粒、原料藥作用于HepG2細胞48、72 h 后，對3種細胞的抑制作用均呈時間依賴性，以前者更明顯。

表1 空白材料對細胞增殖的影響（， n=3）Tab.1 Effect of blank material on cell proliferation（，n=3）

表1 空白材料對細胞增殖的影響（， n=3）Tab.1 Effect of blank material on cell proliferation（，n=3）

2.7 細胞攝取效率考察 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，制成一定質(zhì)量濃度細胞懸液后接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，將培養(yǎng)細胞分為原料藥組和納米粒組，分別加入相關(guān)完全培養(yǎng)基。每組于培養(yǎng)后0.5、2、4 h 停止，收集于離心管中，按細胞傳代的方法制備細胞懸液，合并，離心，棄去上清液，PBS 緩沖液洗滌3次，離心，棄上清，加入100 μL 細胞裂解液，冰浴裂解30 min，每隔10 min 振蕩重懸1次，裂解后置于低溫離心機內(nèi)，12 000 r／min 離心5 min，取上清液，作為細胞裂解液。按照試劑盒說明書測定細胞裂解液中總蛋白濃度，加入適量乙腈超聲15 min 后離心5 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，以細胞裂解液中含藥量與相應(yīng)蛋白量的比值表示細胞對藥物的攝取程度，結(jié)果見表3。由表可知，作用時間為0.5、2、4 h 時，細胞對納米粒的攝取量分別是對原料藥的1.80、1.98、1.73倍，而且給藥后4 h 內(nèi)呈明顯的時間依賴性。

2.8 藥動學研究 12只大鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，將其隨機分為原料藥組和納米粒組，每組6只，禁食不禁水12 h 后，按2 mL／100 g 劑量尾靜脈注射相應(yīng)藥物，于給藥后0.08、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h 眼眥取血，置于肝素化EP 管中，4 000 r／min 低溫離心20 min，得到上清液，即為血漿。取適量血漿加入乙腈混勻后超聲10 min，10 000 r／min 離心15 min 除蛋白，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，進行UPLC-MS／MS分析［22］，繪制血藥濃度-時間曲線，結(jié)果見圖6。由圖可知，原料藥和納米粒均在給藥后5 min 穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的血藥濃度均達到最大值，隨后血漿藥物濃度逐漸降低，與原料藥相比，載藥藥物濃度降低較為緩慢；給藥24 h 后，體內(nèi)藥物約99% 被清除，即穿心蓮內(nèi)酯幾乎被清除完全。

表2 納米粒、原料藥對細胞增殖的影響（， n=3）Tab.2 Effects of nanoparticles and raw medicine on cell proliferation（， n=3）

表2 納米粒、原料藥對細胞增殖的影響（， n=3）Tab.2 Effects of nanoparticles and raw medicine on cell proliferation（， n=3）

注：與同一時間點原料藥比較，?P＜0.05，??P＜0.01

表3 MCF-7細胞藥物攝?。ǎ?n=3）Tab.3 Drug uptake of MCF-7 cells（， n=3）

表3 MCF-7細胞藥物攝?。?， n=3）Tab.3 Drug uptake of MCF-7 cells（， n=3）

注：與原料藥比較，?P＜0.05

然后，通過DAS2.0軟件對以上數(shù)據(jù)進行處理，計算主要藥動學參數(shù)，結(jié)果見表4。由表可知，原料藥、納米粒中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯血藥濃度均在給藥后5 min 達到最大；納米粒體內(nèi)清除明顯慢于原料藥，藥物在體內(nèi)滯留時間更長，AUC 更高。

圖6 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.6 Plasma concentration-time curves for samples

3 討論

由于中藥療效是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，故包載多種成分有利于保持中藥多組分、多靶點、多途徑的特點。本實驗以合成的新型材料透明質(zhì)酸-苯硼酸為載體包載穿心蓮有效部位，制備多藥載藥納米粒，得到了粒徑較小、形態(tài)均一、載藥量和包封率較高的納米粒載藥系統(tǒng)。

表4 樣品主要藥動學參數(shù)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for samples

在釋放性能研究中，納米粒在相同釋放時間內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的累積釋放度相當，而原料藥則沒有這樣的規(guī)律，表明制成納米粒后可使原料藥中不同種類藥物的釋放行為趨于一致。多藥載藥系統(tǒng)中不同藥物的體外釋放行為具有一致性，預(yù)示著其體內(nèi)藥動學行為可能是同步的，這對提高多藥載藥系統(tǒng)的安全性和有效性具有重要意義，也為中藥多藥載藥的研究提供了新途徑。

在抗腫瘤實驗中，原料藥、納米粒與HepG2細胞作用72 h 后對細胞的抑制作用在低質(zhì)量濃度下有顯著差異，而在高濃度下反而沒有，這可能與細胞表面CD44受體過表達量有關(guān)。研究表明，HepG2細胞表面CD44受體的過表達量只有4%，當藥物質(zhì)量濃度較高時，它與受體的結(jié)合達到飽和，細胞對原料藥、納米粒的抑制作用不再有明顯差異，但本實驗并未對此進行相關(guān)研究，還需要進一步探索。

體內(nèi)藥動學實驗結(jié)果表明，納米粒中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯體內(nèi)清除慢于原料藥，這可能是因為制成納米粒后一方面藥物被包裹于材料中而免于清除；另一方面，可使游離的不溶性藥物分子減少，體內(nèi)被免疫細胞（如吞噬細胞）清除降低。另外，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯AUC0～t同步升高，分別增加2.6、2.9倍，表明多藥載藥可使不同藥物的藥動學達到同步，從而發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。

基于多藥載藥的優(yōu)勢，可通過加載不同種類抗腫瘤藥物來治療各種癌癥，不同作用靶點的抗腫瘤藥物加載在同一載體時，也能發(fā)揮多靶點抗腫瘤作用。通過多組分、多靶點、多途徑等協(xié)同作用，可提高藥物對腫瘤的抑制作用，增強腫瘤對藥物的敏感性，還能減少毒性藥物劑量，降低不良反應(yīng)，延長患者生存周期。