劉瑩瑩,徐金鋒*,謝明星,張 麗,覃小娟,項(xiàng)飛翔,丁 楠,楊 暢,項(xiàng)光亞

(1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院超聲科 深圳市超聲醫(yī)學(xué)工程中心,廣東 深圳 518020；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院超聲影像診斷科 湖北省分子影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430022； 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,湖北 武漢 430022)

分子影像學(xué)的發(fā)展給包括超聲在內(nèi)的醫(yī)學(xué)影像學(xué)帶來(lái)巨大變革，也對(duì)超聲造影劑提出了更高要求。本研究嘗試制備一種脂質(zhì)外膜包裹的以液態(tài)氟碳(PFOB)為核心的全新微粒型超聲造影劑，并制備同等脂質(zhì)膜成分的全氟丙烷(C3F8)內(nèi)核的微泡型超聲造影劑，比較二者在粒徑、電位，耐聲壓性及顯影模式等方面的異同。

1.1 制備生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑 以拉丁方設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)以下步驟完成造影劑制備：①采用電子天平(Mettler-Toledo公司)按摩爾質(zhì)量85∶5∶5∶5比例稱取二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)、生物素化磷脂酰乙醇胺(biotinyl phosphatidyl ethanolamine， Biotinyl PE)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dipalmitoyl phosphatidylglycerole， PPPG)及膽固醇(cholesterol， CH)；DPPC為脂質(zhì)外膜基本成分，Biotinyl PE為后續(xù)進(jìn)行親和素橋連修飾提供連接位點(diǎn)，DPPG帶負(fù)電荷可調(diào)節(jié)納米粒表面電位，CH用以調(diào)節(jié)脂質(zhì)外膜流動(dòng)性；將試劑置于圓底燒瓶中，移至通風(fēng)櫥內(nèi)，于燒瓶?jī)?nèi)加入15～20 ml氯仿與甲醇混合溶液(體積比3∶1)，溶解直至澄清；②將燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，抽真空蒸發(fā)2 h(調(diào)節(jié)水浴溫度為30℃，轉(zhuǎn)速40 rot/min)，形成均勻薄膜；③稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)，加入去離子水配成0.1 g/mol的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)，采用精密pH計(jì)(上海精科雷磁儀器廠)將pH值調(diào)節(jié)至7.0；④稱取20 ml PBS加入蒸干成膜的圓底燒瓶?jī)?nèi)，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，水化1 h(調(diào)節(jié)水浴溫度為55℃，轉(zhuǎn)速60 rot/min)，得到乳白色母液；⑤將母液移至燒杯中，以高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)攪拌，同時(shí)逐滴加入0.2 ml PFOB；⑥將所得混懸液置于水浴超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)中，超聲處理1 min；⑦將200 nm聚碳酸酯濾膜裝入脂質(zhì)體擠出器，置于配套水浴鍋中，調(diào)節(jié)水浴溫度為55℃；將超聲處理后的母液加入脂質(zhì)體擠出器內(nèi)，連接氮?dú)馄?，打開(kāi)氣壓閥門(mén)，壓力范圍穩(wěn)定在0.5～1.0 MPa，進(jìn)行過(guò)膜處理，重復(fù)3次，得到生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑。

1.2 制備生物素化C3F8脂質(zhì)微泡造影劑 前6步制備過(guò)程同前，步驟⑦時(shí)將超聲處理后母液加入注射器內(nèi)，并將超聲細(xì)胞破碎儀(Misonix公司)探頭(頻率20 kHz，功率150 W)置于液面下1.5 cm，同時(shí)抽取氟碳?xì)怏w50 ml；于聲振過(guò)程中經(jīng)三通管由注射器底部緩慢推注氣體。選擇間斷模式，輸出功率為110 W，聲振3 s，停2 s，重復(fù)3次，得到生物素化C3F8脂質(zhì)微泡造影劑。

1.3 基本理化性質(zhì)測(cè)定及穩(wěn)定性評(píng)估 取適量生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒、C3F8脂質(zhì)微泡，稀釋10倍后[濃度分別為(2.07±0.56)×109/ml和(3.79±0.82)×108/ml]于光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)或透射電子顯微鏡(FEI公司)下觀察其形態(tài)，以激光粒度分析儀(Malvern公司)測(cè)定其粒徑及表面電位。加入親和素后再次觀察2種造影劑形態(tài)改變并測(cè)定其粒徑。

穩(wěn)定性評(píng)估：分別于制備后即刻及常溫下將PFOB脂質(zhì)納米粒及C3F8脂質(zhì)微泡放置1、3、6、12、24、48 h后抽取樣品，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算其濃度。

1.4 造影劑體外顯影效果觀察 將適量生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒、C3F8脂質(zhì)微泡分別稀釋10倍后(濃度同前)置于10 ml EP管內(nèi)備用。采用Siemens Acuson Sequoia 512彩色超聲診斷儀，15L8w-s高頻探頭(頻率10～14 MHz)，選擇Small Part模式、基波成像，觀察2種造影劑樣本顯影情況并采集圖像；加入0.5 mg親和素后再次觀察其顯影效果并采集圖像。

1.5 測(cè)定造影劑耐聲壓性 取生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒、C3F8脂質(zhì)微泡分別稀釋10倍(濃度同前)后置于10 ml EP管內(nèi)， 加入0.5 mg親和素后備用。采用Siemens Acuson Sequoia 512彩色超聲診斷儀，15L8w-s高頻探頭(頻率10～14 MHz)，調(diào)節(jié)探頭輸出功率，分別在機(jī)械指數(shù)(mechanical index， MI)0.28和0.56水平進(jìn)行超聲輻照，于輻照前及輻照10、20、30 s后觀察顯影情況有無(wú)變化，采集圖像；將原始圖像轉(zhuǎn)化為JPG及AVI格式，刻錄至光盤(pán)保存。

采用Metlab 7.8軟件分析采集到的JPG圖像，將ROI設(shè)定為EP管內(nèi)造影劑所在區(qū)域，測(cè)算其平均灰度值(gray scale， GS)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0軟件。計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分率表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較2種造影劑，以配對(duì)t檢驗(yàn)比較同一造影劑加入親和素前后差異；同一造影劑多個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組內(nèi)進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本理化性質(zhì)測(cè)定及加入親和素前后比較 電子顯微鏡下觀察，加入親和素前，生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒分散度良好(圖1A)，表面電位為(-43.70±7.17)mV，粒徑(173.30±48.81)nm(圖1B)；加入親和素后納米粒聚集成團(tuán)(圖1C)，粒徑(1026.00±142.7)nm(圖1D)，較前明顯增大(t=-9.243,P<0.001)。光學(xué)顯微鏡下觀察，生物素化C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素前分散度良好(圖1E)，表面電位為(-13.00±5.99)mV，粒徑(868.50±126.40)nm(圖1F)；加入親和素后微泡發(fā)生聚集(圖1G)，粒徑(1446.00±221.20)nm(圖1H)，較前明顯增大(t=-6.597,P=0.003)。加入親和素前(t=16.225，P<0.001)、后(t=-5.046，P<0.001)2種造影劑間粒徑差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒、C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素前后理化性質(zhì) A、B.生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒加入親和素前電子顯微鏡下可見(jiàn)粒徑均勻，分散度好(A)，粒徑分布圖示平均粒徑為173.30 nm(B)； C、D.生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒加入親和素后電子顯微鏡下可見(jiàn)納米粒聚集成團(tuán)(C)，粒徑分布圖示平均粒徑為1026.00 nm(D)； E、F.生物素化C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素前光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)粒徑均勻，分散度好(E)，粒徑分布圖示平均粒徑為868.50 nm(F)； G、H.生物素化C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素后光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)微泡間出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(G)，粒徑分布圖示平均粒徑為1446.00 nm(H)

圖2 PFOB脂質(zhì)納米粒與C3F8脂質(zhì)微泡體外穩(wěn)定性比較 A.PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑濃度隨時(shí)間變化情況； B.C3F8脂質(zhì)微泡造影劑濃度隨時(shí)間變化情況 (*表示與制備后即刻比較，P<0.05)

圖3 生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒加入親和素前后CEUS表現(xiàn) A、B.生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒加入親和素前顯示為無(wú)回聲(A)，加入親和素后回聲明顯增強(qiáng)，顯示為密集細(xì)小的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(B)； C、D.生物素化C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素前顯示為密集細(xì)小點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(C)，加入親和素后未見(jiàn)明顯變化，仍顯示為密集細(xì)小點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(D)

2.2 造影劑穩(wěn)定性比較 監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，PFOB脂質(zhì)微粒在整個(gè)觀察期間內(nèi)濃度無(wú)明顯改變(圖2A)；C3F8脂質(zhì)微泡制備后隨放置時(shí)間延長(zhǎng)濃度呈減低趨勢(shì)(P<0.05)，放置6 h及以內(nèi)濃度較尚未發(fā)生明顯改變，而放置12、24、48 h后濃度均較制備后即刻明顯減低(P均<0.05，圖2B)。

2.3 體外顯影效果比較 生物素化PFOB脂質(zhì)納米粒加入親和素前回聲信號(hào)極低，接近無(wú)回聲(圖3A)；加入親和素后回聲明顯增強(qiáng)，呈密集細(xì)小的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(圖3B)。生物素化C3F8脂質(zhì)微泡加入親和素前即有較好顯影效果，表現(xiàn)為密集細(xì)小的點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(圖3C)，加入親和素后未見(jiàn)明顯變化(圖3D)。

2.4 造影劑耐聲壓性比較 PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑在低聲壓(MI=0.28)及高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下，隨輻照時(shí)間延長(zhǎng)，顯影強(qiáng)度均未見(jiàn)明顯改變(圖4、5，表1)。

在低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下，隨輻照時(shí)間延長(zhǎng)，C3F8脂質(zhì)微泡顯影信號(hào)強(qiáng)度有減低趨勢(shì)(P<0.05,圖6、表1)，輻照10 s后顯影強(qiáng)度尚未見(jiàn)明顯改變(P>0.05)，而輻照20 s后顯影強(qiáng)度明顯減低(P<0.05)，輻照30 s后顯影強(qiáng)度進(jìn)一步減低(P<0.05，圖7)；高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下，隨輻照時(shí)間延長(zhǎng)，其顯影信號(hào)強(qiáng)度亦有減低趨勢(shì)(P<0.05；圖8，表1)，輻照10 s后顯影強(qiáng)度即明顯減低(P<0.05)，輻照20、30 s后顯影強(qiáng)度均進(jìn)一步減低(P均<0.05，圖9)。

表1 PFOB脂質(zhì)納米粒/ C3F8脂質(zhì)微泡造影劑在低聲壓及高聲壓環(huán)境下不同輻照時(shí)間顯影強(qiáng)度比較

圖5 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑不同超聲輻照時(shí)間顯影情況 A～D.分別為PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑經(jīng)超聲輻照前(A)及輻照10(B)、20(C)、30 s(D)后的顯影情況

3 討論

分子影像技術(shù)需要能夠特異性反映靶組織在分子水平上病變進(jìn)程的示蹤物，并能以信號(hào)增強(qiáng)的形式反映在可視性圖像上。在超聲分子影像領(lǐng)域，這種示蹤物就是靶向超聲造影劑。靶向超聲造影劑粒徑小，可穿過(guò)血管內(nèi)皮間隙到達(dá)靶組織，外膜可攜載多種功能性化學(xué)基團(tuán)便于表面修飾，在聲場(chǎng)中穩(wěn)定性更高、在循環(huán)中的半衰期更長(zhǎng)，背景信號(hào)更低，且能與目前臨床使用的超聲成像系統(tǒng)兼容[1-2]。與傳統(tǒng)微泡型造影劑相比，本研究自制PFOB納米粒型造影劑在穿透力、顯影模式、SNR及耐聲壓性方面均具明顯優(yōu)勢(shì)。

傳統(tǒng)超聲造影劑粒徑約數(shù)微米，臨床多用以顯示整個(gè)血池系統(tǒng)的分布及完整性[3]，很難穿越血管內(nèi)皮屏障，不能直接進(jìn)入靶組織與靶細(xì)胞結(jié)合而反映病理進(jìn)程及分子參與情況。本研究制備的PFOB脂質(zhì)納米粒和C3F8脂質(zhì)微泡的粒徑分別為(173.30±48.81)nm和(868.50±126.40)nm，PFOB納米脂質(zhì)納米粒造影劑的粒徑更小，穿透力更強(qiáng)，更易穿過(guò)血管內(nèi)皮屏障進(jìn)入靶組織；且PFOB納米粒內(nèi)核呈液態(tài)，抗剪切力能力更強(qiáng)。

圖6 低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下C3F8脂質(zhì)微泡造影劑不同超聲輻照時(shí)間顯影情況 A.超聲輻照前C3F8脂質(zhì)微泡聲像圖； B.輻照10 s后，未見(jiàn)明顯微泡破壞； C.輻照20 s后，可見(jiàn)明顯微泡破壞； D.輻照30 s后，可見(jiàn)大量微泡破壞

圖7 低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下C3F8脂質(zhì)微泡造影劑不同輻照時(shí)間顯影強(qiáng)度比較 (*表示與輻照前比較，P<0.05；△表示與輻照10 s后比較，P<0.05；§表示與輻照20 s后比較，P<0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)C3F8脂質(zhì)微泡造影劑在游離狀態(tài)即能產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)。加入親和素后，雖然粒徑測(cè)量結(jié)果與顯微鏡下觀察均證實(shí)微泡發(fā)生聚集，但與游離狀態(tài)時(shí)相比其顯影信號(hào)強(qiáng)度并無(wú)明顯增強(qiáng)，在靶向造影圖像中很難區(qū)分聚集至靶器官的微泡與循環(huán)中游離的微泡。

PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑的聲學(xué)顯影模式與傳統(tǒng)微泡型造影劑截然不同，其在游離狀態(tài)下產(chǎn)生的回聲信號(hào)非常微弱；加入親和素后，生物素化的PFOB納米粒信號(hào)得到明顯增強(qiáng)[4-5]。靶向造影時(shí)，PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑在未靶向結(jié)合至靶組織前以游離狀態(tài)存在，只產(chǎn)生極微弱信號(hào)；其靶向結(jié)合至靶組織并在其周?chē)奂螅a(chǎn)生的信號(hào)明顯增強(qiáng)，超聲診斷的敏感度及特異度也隨之提高。

靶向造影對(duì)造影劑在血液循環(huán)中持續(xù)的時(shí)間和其在聲場(chǎng)中的顯影時(shí)間均有較高要求。循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)是造影劑發(fā)揮靶向作用的基礎(chǔ)；而靶向造影過(guò)程中也需要足夠時(shí)間進(jìn)行觀察及重復(fù)探察。因此，耐聲壓性是考驗(yàn)靶向超聲造影劑的重要指標(biāo)之一。

本研究對(duì)比觀察2種造影劑耐聲壓性能，在低聲壓及高聲壓環(huán)境下，C3F8脂質(zhì)微泡接受一定時(shí)間超聲輻照后顯影強(qiáng)度即發(fā)生明顯下降，而PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑無(wú)論是在低聲壓環(huán)境還是高聲壓環(huán)境中的顯影強(qiáng)度在觀察時(shí)間內(nèi)均保持穩(wěn)定。目前普遍認(rèn)為MI<0.3的聲壓環(huán)境為低聲壓環(huán)境，處在這種聲場(chǎng)之中的微泡不易被聲能破壞，從而能夠獲得較為理想的顯影效果；而當(dāng)微泡處在高聲壓環(huán)境之中，其中的氣體就會(huì)在聲壓作用下被動(dòng)的發(fā)生劇烈的壓縮與膨脹，導(dǎo)致微泡外殼破裂，氣體逸出，喪失顯影能力[6-8]。因此，為盡可能保護(hù)微泡不受聲壓破壞，獲得較理想的顯影效果，對(duì)微泡型造影劑一般選用低能量超聲顯影模式且在長(zhǎng)時(shí)間觀察顯影情況時(shí)需用間斷成像模式[9-10]，這在一定程度上會(huì)影響顯影過(guò)程的時(shí)間分辨率。PFOB脂質(zhì)納米粒造影劑則不受此局限，其核心材料PFOB在常溫下為液態(tài)，且密度較大(1.93 g/ml)，具有良好的抗壓能力，即使在較高的聲壓環(huán)境下也不會(huì)被破壞，從而使其顯影效果得以維持。既往研究[5]報(bào)道，其在體內(nèi)造影過(guò)程中顯影時(shí)間可達(dá)1～2天。

圖8 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下C3F8脂質(zhì)微泡造影劑不同超聲輻照時(shí)間顯影情況 A.超聲輻照前C3F8脂質(zhì)微泡聲像圖； B.輻照10s后即可見(jiàn)明顯微泡破壞； C.輻照20 s后，可見(jiàn)大量微泡破壞； D.輻照30 s后，可見(jiàn)大量微泡破壞

圖9 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下C3F8脂質(zhì)微泡造影劑不同輻照時(shí)間顯影強(qiáng)度比較 (*表示與輻照前比較，P<0.05；△表示與輻照10 s后比較，P<0.05；§表示與輻照20 s后比較，P<0.05)

綜上所述，較之C3F8脂質(zhì)微泡造影劑，以PFOB為核心的納米脂質(zhì)納米粒造影劑粒徑更小，耐聲壓性能更好，更符合靶向超聲造影的要求。