譚卉卉，林燦輝，李街青，陳佳玲，史建強(qiáng)*，陳嶸祎,*，劉 勝波（.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 5403；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 5400）

國(guó)內(nèi)外大量研究表明IL-17可參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)[1-4]，也可以通過(guò)誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)及趨化因子的產(chǎn)生而導(dǎo)致機(jī)體組織器官的損傷。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇(E2)與ER結(jié)合后可以募集雌激素活性抑制因子(REA)，作用于維甲酸依賴(lài)性孤核受體γt(ROR-γt)啟動(dòng)子區(qū)域的雌激素反應(yīng)元件(ERE)，抑制ROR-γt的表達(dá)，從而抑制Th17分化[5]。但E2有抑制炎癥和促進(jìn)炎癥的雙重作用，不但可以通過(guò)上調(diào)REA、抑制RORγt表達(dá)以遏制Th17細(xì)胞的分化，還可促進(jìn)Th2細(xì)胞及漿細(xì)胞分化分泌自身免疫性抗體，參與SLE發(fā)病，因此不能直接采用E2治療SLE。抑制素2(PHB2)是蛋白抑制素家族中的一員[6]，可選擇性地抑制ER的轉(zhuǎn)錄活性，有效抑制Th17細(xì)胞分化及IL-17表達(dá)。由于REA-慢病毒過(guò)表達(dá)技術(shù)能夠穩(wěn)定表達(dá)REA，因此我們通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)上調(diào)REA的表達(dá)、抑制Th17細(xì)胞的分化，進(jìn)而減少I(mǎi)L-17的分泌，以期驗(yàn)證該方法治療SLE的可行性。

1 材料和方法

1.1 Phb2過(guò)表達(dá)慢病毒載體

慢病毒載體的構(gòu)建、合成、測(cè)試均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供，本實(shí)驗(yàn)最終所制備的GV358-Phb2過(guò)表達(dá)慢病毒載體元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。陰性對(duì)照病毒CON248(對(duì)應(yīng)目的病毒)元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP。

1.2 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的分離和純化

頸椎脫臼法處死C57/BL6J小鼠后置于75%酒精溶液中浸泡2 min，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD蘇凈安泰)中取出小鼠脾臟，置于盛有PBS(20012-043)的培養(yǎng)皿(60 mm)中；剔除脾臟以外多余的脂肪組織，并予PBS漂洗2次；剪碎脾臟，用磨砂玻片輕輕研磨至組織發(fā)白，再將研磨液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞篩(70 μm)中過(guò)濾，獲得細(xì)胞懸濁液，混合均勻后用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至盛有小鼠淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(注意不要將分離液粘在管壁上)，使細(xì)胞懸濁液懸于淋巴細(xì)胞分離液上，再將懸液以500 r/min離心30 min，吸取從上數(shù)第二層懸液至新的離心管中，并予PBS重懸，吹打混勻，以320 r/min離心5 min，棄上清，加2 mL紅細(xì)胞裂解液(PBS : 紅細(xì)胞裂解液=4 : 1)，用吸管伸至離心管底部吹打混勻5 min后再加8 mL PBS終止裂解反應(yīng)，再次吹打混勻，以320 r/min 離心5 min，棄上清。再次加入PBS液清洗1遍，棄上清，予PBS重懸。采用免疫磁珠法分離純化T淋巴細(xì)胞[6]，最后加入1 mL(FBS+RPMI-1640)培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，鑒定細(xì)胞活力。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)設(shè)立5個(gè)組：空白組、空載體組、慢病毒組、Th17分化組和Th17+慢病毒組。每皿加入2 mL培養(yǎng)基并接種1×107個(gè)淋巴細(xì)胞，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞最適MOI(multiplicity of infection) 值為10，計(jì)算出所需要的病毒體積[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù))/病毒滴度]；空載體組加入不含目的基因的病毒液；慢病毒組加入病毒液，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，將其分別轉(zhuǎn)移至5支15 mL離心管中，以300 r/min 離心 5 min后棄上清，予4 mL常規(guī)培養(yǎng)液重懸，如表1分別加入刺激因子。提前2 h以anti-CD1=3ε(2 mg/L，Biolegend，Cat.100314) 分別覆蓋6個(gè)直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，37 ℃ 孵化2 h，再予PBS漂洗2次備用。將加入上述刺激因子的重懸液分別轉(zhuǎn)移到備用的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，詳細(xì)過(guò)程可參考文獻(xiàn)[8]，于熒光顯微鏡下觀察并測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，最后提取RNA行Realtime-PCR檢測(cè)。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)

收集上述5組細(xì)胞，使用RNeasy Mini kit (QIAGEN，Cat.74106) 提取細(xì)胞RNA，用iScript cDNA合成試劑盒(BIO-RAD，Cat.170-8891)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入iQ SYBR Green Supermix DNA聚合酶混合物(BIORAD，Cat.170-8882)后，使用Master Cycler Gradient PCR儀(擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s預(yù)變性→95 ℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)→熒光融解得到融解曲線)檢測(cè)REA、IL-17a、RORγt、GAPDH的mRNA表達(dá)情況。REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列見(jiàn)表2。

表1 5組細(xì)胞的處理方法

表2 REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析和Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Phb2/REA慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞

熒光表達(dá)約80%，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，REA過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖1。

圖1 病毒轉(zhuǎn)染后72 h熒光圖

2.2 RT-qPCR檢測(cè)

Th17+慢病毒組的REA、RORγt mRNA表達(dá)較慢病毒組高，且慢病毒組、Th17+慢病毒組REA、RORγt的mRNA明顯高于Th17分化組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；空載體組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2、3。Th17分化組的IL-17A mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，且高于Th17+慢病毒組(P<0.01)；空白組、空載體組、慢病毒組的IL-17A mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后REA的mRNA 表達(dá)情況

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后RORγt的mRNA表達(dá)情況

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后 IL-17a 的mRNA表達(dá)情況

3 討論

Th17細(xì)胞是2005年發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，以選擇性分泌細(xì)胞因子IL-17為特征[8]，其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子主要是RORγt[10-11]。Th17細(xì)胞的分化過(guò)程不同于Th1和Th2。當(dāng)機(jī)體遭受病原體時(shí)，其先合成IL-6和TGFβ，繼而誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt，調(diào)控Th17細(xì)胞的分化。而IL-23既可以誘導(dǎo)IL-17的產(chǎn)生，與受體結(jié)合后也可以啟動(dòng)JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)Th17細(xì)胞成熟[1,12]。

E2參與細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié)及抗原的呈遞，在抑制炎癥的同時(shí)也能促進(jìn)炎癥的發(fā)生。E2可以通過(guò)上調(diào)REA募集HDAC1、HDAC2的方式抑制RORγt的表達(dá)[13]，遏制Th17細(xì)胞分化。其過(guò)程可能是通過(guò)抑制IL-17的分泌，亦可能是通過(guò)促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化參與SLE的發(fā)病，因此不能直接采用E2治療SLE。

我們預(yù)期采用Phb2(REA)慢病毒過(guò)表達(dá)技術(shù)促進(jìn)REA表達(dá)，從而下調(diào)RORγt抑制Th17細(xì)胞的分化，探討治療SLE的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA表達(dá)較慢病毒組高，且慢病毒組和Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA明顯高于TH17分化組，空載體組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TH17分化組IL-17A的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，且TH17分化組IL-17的mRNA表達(dá)明顯高于Th17+慢病毒組(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示REA上調(diào)的同時(shí)RORγt也上調(diào)，但Phb2(REA)慢病毒過(guò)表達(dá)載體在Th17分化條件下可明顯抑制IL-17A表達(dá)，表明Th17細(xì)胞的分化過(guò)程受到了抑制。雖然這一機(jī)制與E2通過(guò)RORγt抑制Th17的分化不同，但該方法卻能有效抑制IL-17A的表達(dá)，提示Phb2(REA)慢病毒過(guò)表達(dá)載體有望成為治療Th17細(xì)胞免疫紊亂相關(guān)性疾病如SLE、銀屑病等的新方案。我們推測(cè)Phb2(REA)慢病毒過(guò)表達(dá)載體未能抑制RORγt的原因可能與細(xì)胞對(duì)REA高表達(dá)的反應(yīng)性，即反饋性上調(diào)RORγt的表達(dá)有關(guān)。由于實(shí)驗(yàn)只是初步探討了Phb2/REA過(guò)表達(dá)慢病毒載體對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響，至于慢病毒是通過(guò)何種途徑參與抑制Th17細(xì)胞的分化過(guò)程，其具體影響機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。