王屋梁，李 凱，楊曉宇，曹培讓，劉元法

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122； 2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122； 3.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122； 4.無錫德合食品科技有限公司，江蘇 無錫 214122)

花生是四大油料作物之一，種植面積居油料作物第二位，脂肪含量為47%～50%[1]。花生油中脂肪酸主要為不飽和脂肪酸，其中油酸和亞油酸含量豐富?；ㄉ鸵蜃涛犊煽凇馕斗曳?，深受我國居民喜愛。研究表明花生油對人體健康大有益處，可以降低患心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。

隨著生活水平和健康意識的不斷提高，人們對食用油脂的品質(zhì)提出了更高的要求。目前，工業(yè)上花生油的制取工藝主要為溶劑浸出法和高溫壓榨法，其中溶劑浸出法是最常用的一種制油工藝，但存在生產(chǎn)安全隱患、溶劑殘留等問題[5]。高溫壓榨法雖可以增強(qiáng)花生油的香味，但會(huì)使其色澤加深、雜質(zhì)含量增加，并且高溫壓榨使花生蛋白嚴(yán)重變性，所得花生餅只能作為廉價(jià)的飼料[6]。低溫冷榨法避免了高溫處理而導(dǎo)致的油脂中營養(yǎng)成分流失，所得的油脂色澤淺、雜質(zhì)少、風(fēng)味純正，同時(shí)冷榨較大程度上避免和減少餅蛋白質(zhì)的變性[7]，可以提高油料的綜合利用率。水酶法是在水代法的基礎(chǔ)上利用酶對油料細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，促使油脂釋放，反應(yīng)條件溫和，所得油脂品質(zhì)高，同時(shí)也能有效回收油料中蛋白質(zhì)[8]。

本研究采用低溫壓榨法、高溫壓榨法和水酶法制取花生油，分別對其色澤、酸價(jià)、過氧化值及氧化穩(wěn)定指數(shù)進(jìn)行測定，采用氣相色譜測定脂肪酸組成及角鯊烯含量，利用高效液相色譜測定生育酚含量，使用分光光度計(jì)測定多酚含量，同時(shí)測定DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，借此對所得花生油的營養(yǎng)和品質(zhì)進(jìn)行綜合評價(jià)，以期為花生油生產(chǎn)及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生仁，購自山東；甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三氟化硼、乙醚、酚酞、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、碳酸鈉、DPPH(二苯代苦味酰基自由基)試劑、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox、ABTS(2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、過硫酸鉀，均購自J & K公司；甲醇(色譜純)、正己烷(色譜純)、異丙醇(色譜純)、焦性沒食子酸、福林酚試劑、脂肪酸甲酯混標(biāo)、生育酚混標(biāo)(純度95%)、角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，均購于Sigma公司；磷酸緩沖液，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自備；Alcalase 2.4L，購自諾維信公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱；半粒脫皮機(jī)；液壓榨油機(jī)；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋；RW-20電動(dòng)攪拌器，德國IKA公司；羅維朋比色儀；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHB-3循環(huán)水真空泵；TGL-16G型臺式離心機(jī)；EL204電子天平,上海梅特勒托利多儀器有限公司；KQ-300 DE數(shù)控超聲波清洗器；Mini-240分光光度計(jì)，日本島津公司；Diol-SPE二醇基固相萃取小柱(500 mg, 6 mL)，上海安普公司；Rancimat 743 氧化穩(wěn)定儀，瑞士Rancimat公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Agilent 7820氣相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生油的制取

冷榨法：取一定量花生仁，置于60℃烘箱中10 h,取出冷卻、脫皮，液壓榨油機(jī)壓榨，將所得油樣于4 500 r/min離心15 min，得到冷榨花生油。

熱榨法：取一定量花生仁，置于150℃烘箱中75 min,取出冷卻、脫皮，液壓榨油機(jī)壓榨，將所得油樣于4 500 r/min離心15 min，得到熱榨花生油。

水酶法：取一定量花生仁，置于60℃烘箱中10 h, 取出冷卻、脫皮，參照Deng等[9]的方法，按料液比1∶5加水磨漿，在Alcalase 2.4L蛋白酶添加量1.5%、60℃、pH 8.5條件下酶解3 h，升溫至90℃，并保持10 min；將所得油樣于4 500 r/min 離心15 min,靜置，取上層，得到水酶法花生油。

1.2.2 基本理化指標(biāo)測定

酸價(jià)，參照GB 5009.229—2016;過氧化值，參照GB 5009.227—2016;色澤，參照GB/T 22460—2008；氧化穩(wěn)定性，參照GB/T 21121—2007,用Rancimat 743 氧化穩(wěn)定儀測定。

1.2.3 脂肪酸組成分析

氣相色譜條件：TR-FAME柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)?0℃保持3 min，以5℃/min 升溫至175℃保持15 min，再以2℃/min升溫至220℃保持10 min；分流比100∶1；檢測器、進(jìn)樣口溫度220℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 生育酚含量測定

參照Li等[12]的方法采用HPLC進(jìn)行測定。稱取1.0 g油樣，精確至0.001 g，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入正己烷超聲溶解定容后，過0.22 μm 有機(jī)膜，取20 μL進(jìn)樣。

HPLC條件：Nucleosil Silica 柱(20 cm×4 mm×5 μm)；流動(dòng)相為正己烷-異丙醇(體積比98.5∶1.5)；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長295 nm。

配制質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、100、200、400 μg/mL混合生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的正己烷溶液，進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法測定生育酚含量。

1.2.5 多酚含量測定

參照Herchi等[13]的方法測定多酚含量。分別取6 mL甲醇和6 mL正己烷活化SPE柱，再用6 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比 99∶1)溶液緩沖系統(tǒng)。稱取6.0 g油樣，精確至0.001 g，溶于12 mL正己烷中過柱，用12 mL正己烷洗脫非極性物質(zhì)，再加入6 mL甲醇洗脫，得到多酚提取液，后將其濃縮至1 mL,加入福林酚0.5 mL，反應(yīng)5 min后，加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液，用去離子水定容至10 mL，放置于暗處反應(yīng)2 h，765 nm處測定吸光度。

用焦性沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)品，參照GB/T 8313—2008 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法測定多酚含量。

1.2.6 角鯊烯含量測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法，采用氣相色譜測定角鯊烯含量。氣相色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?60℃，以15℃/min升溫至220℃保持2 min，再以10℃/min 升溫至280℃保持10 min；分流比20∶1；檢測器、進(jìn)樣口溫度280℃；進(jìn)樣量1 μL。

配制質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的正己烷溶液，進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度與峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法測定角鯊烯含量。

1.2.7 DPPH自由基清除能力測定

（107）黃羽苔 Xenochila integrifolia（Mitt.）Inoue.楊志平（2006）

1.2.7.1 極性組分DPPH自由基清除能力

極性萃取液的制備：稱取4.0 g油樣，加入5 mL甲醇，避光振蕩30 min 混勻，3 000 r/min 離心15 min,靜置，待分層后取上清液，重復(fù)以上操作4次，合并萃取液，甲醇定容。

DPPH自由基清除能力測定：參考文獻(xiàn)[15]的方法，略作改動(dòng)。取2 mL上述極性萃取液，與2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液混合，避光放置2 h,517 nm處測定吸光度；DPPH自由基清除能力以μmolTE/100 g(以油質(zhì)量計(jì)，下同)表示。

1.2.7.2 非極性組分、全油樣品DPPH自由基清除能力

非極性萃取液的制備：取適量的萃取后殘余的非極性部分，用乙酸乙酯定容。

全油樣品的制備：稱取適量油樣，用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的樣液。

DPPH自由基清除能力測定：將甲醇替換成乙酸乙酯，其余同極性組分DPPH自由基清除能力測定。

1.2.8 ABTS自由基清除能力測定

ABTS工作液制備：參考Marfil等[16]的方法，配制ABTS反應(yīng)儲(chǔ)備液，使用前用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4) 稀釋,使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.002。

ABTS自由基清除能力測定：取1.2.7.1中的極性萃取液20 μL與1 980 μL ABTS工作液振蕩混合，30℃下反應(yīng)10 min,734 nm處測定吸光度；ABTS自由基清除能力以μmolTE/100 g表示。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。顯著性差異采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)以及DUCAN檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同制油工藝花生油基本理化指標(biāo)(見表1)

表1 不同制油工藝花生油的色澤、酸價(jià)、過氧化值和氧化穩(wěn)定指數(shù)(OSI)比較

注：結(jié)果以”平均值±s”表示;同一列不同字母表示有顯著性差異(p<0.05);下同。

由表1知，水酶法花生油酸價(jià)最高，過氧化值最低，OSI最高。酸價(jià)高可能與甘油三酯在酶和水分的作用下分解生成游離脂肪酸和甘油有關(guān)。熱榨花生油的色澤最深，過氧化值最高，OSI最低，這可能是因?yàn)楦邷睾婵炯皦赫スば蛴兄谥苄陨氐娜艹?，同時(shí)在高溫過程中花生中的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物使得熱榨油的色澤進(jìn)一步加深。在高溫烘烤條件下，油脂易發(fā)生氧化，使得過氧化值升高，OSI降低。而冷榨花生油因制取條件溫和，其酸價(jià)及過氧化值均低于熱榨花生油，OSI高于熱榨花生油。

2.2 不同制油工藝花生油脂肪酸組成(見表2)

表2 不同制油工藝花生油的脂肪酸組成 %

注：同一行不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。

由表2知，花生油的脂肪酸組成主要以棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)為主，其中油酸和亞油酸的含量約占78%。對比3種花生油可知，3種花生油的脂肪酸組成無差別，而水酶法花生油的油酸含量顯著高于冷榨花生油和熱榨花生油(p<0.05)，亞油酸含量顯著低于冷榨花生油和熱榨花生油(p<0.05)。

2.3 不同制油工藝花生油微量活性成分含量

2.3.1 生育酚含量(見圖1)

注：結(jié)果以“平均值±s”表示；同一柱形上方不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)；下同。

圖1 不同制油工藝花生油的生育酚含量比較

生育酚是一種很好的抗氧化劑，有4種單體即α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。由圖1知，花生油中生育酚以α-生育酚和γ-生育酚為主，占總生育酚含量的83%～90%，β-生育酚及δ-生育酚含量極低，這與文獻(xiàn)[17]的研究結(jié)果一致。熱榨花生油的α-生育酚和總生育酚含量分別為(124.57±0.03)mg/kg、(206.61±3.24)mg/kg，顯著高于冷榨花生油及水酶法花生油(p<0.05)。這可能是因?yàn)楦邷睾婵居兄谥景殡S物的溶出，同時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以保護(hù)生育酚不被氧化。在長時(shí)間的酶解條件下，水酶法花生油中生育酚因結(jié)構(gòu)被破壞，含量降低。

2.3.2 多酚含量(見圖2)

圖2 不同制油工藝花生油的多酚含量比較

酚類物質(zhì)具有抗氧化作用。研究表明，酚類化合物具有保護(hù)心臟、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)、抗癌等功效[18]。由圖2知，熱榨花生油的多酚含量為(44.27±2.60)mgGAE/kg，顯著高于冷榨花生油和水酶法花生油(p<0.05)，而冷榨花生油和水酶法花生油中多酚含量無顯著差異(p>0.05)。這可能是因?yàn)楦邷睾婵具^程中，多酚多聚物的化學(xué)鍵斷裂，釋放出更多的多酚，同時(shí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在一定程度上可以保護(hù)多酚不被氧化。多酚是極性物質(zhì)，在水酶法提取花生油的過程中，多酚極易溶于水相，使得油相中的多酚含量減少[19]。

2.3.3 角鯊烯含量(見圖3)

圖3 不同制油工藝花生油的角鯊烯含量比較

角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗疲勞、抗癌等多種生理功能。由圖3知，冷榨花生油的角鯊烯含量為(477.20±10.31) mg/kg，顯著高于熱榨花生油和水酶法花生油(p<0.05)，這可能是由于角鯊烯是一種不穩(wěn)定的物質(zhì)[20]，其結(jié)構(gòu)受熱易被破壞。高溫烘烤、酶解都會(huì)使角鯊烯結(jié)構(gòu)受到不同程度的破壞，從而使得其含量降低。熱榨花生油和水酶法花生油的角鯊烯含量無顯著差異(p>0.05)。

2.4 不同制油工藝花生油DPPH自由基和ABTS自由基清除能力(見表3)

由表3知，熱榨花生油全油、極性組分及非極性組分的DPPH自由基清除能力均顯著高于冷榨花生油和水酶法花生油(p<0.05)，冷榨花生油除極性組分的DPPH自由基清除能力顯著低于水酶法花生油(p<0.05)外，其全油及非極性組分的DPPH自由基清除能力與水酶法花生油無顯著差異(p>0.05)。比較全油、極性組分和非極性組分的DPPH自由基清除能力可知，花生油中的極性組分與非極性組分均具有清除自由基的作用，同時(shí)花生油全油的DPPH自由基清除能力不等于這兩個(gè)組分的簡單相加。全油的DPPH自由基清除能力高于非極性組分，這說明花生油中的極性組分在乙酸乙酯體系中起到了清除自由基的作用。全油的DPPH自由基清除能力卻低于極性組分，這有可能是因?yàn)橐宜嵋阴サ捏w系抑制了某些微量活性成分的抗氧化作用，使得自由基清除能力下降[21]。

由表3知，熱榨花生油清除ABTS自由基能力顯著高于冷榨花生油和水酶法花生油(p<0.05)，冷榨花生油的ABTS自由基清除能力與水酶法花生油無顯著差異(p>0.05)。

表3 不同制油工藝花生油的自由基清除能力比較 μmolTE/100 g

3 結(jié) 論

(1)水酶法花生油色澤(Y19.5R1)最淺，酸價(jià)(KOH)((0.66±0.05)mg/g)最高，過氧化值((2.05±0.00)mmol/kg)最低，氧化穩(wěn)定指數(shù)((3.95±0.11)h)最高。

(2)花生油的脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸組成，油酸和亞油酸含量約占78%。水酶法花生油中油酸含量最高，為(50.73±0.43)%。

(3)熱榨花生油中α-生育酚、總生育酚和多酚含量最高，分別為(124.57±0.03)mg/kg、(206.61±3.24)mg/kg、(44.27±2.60)mgGAE/kg；冷榨花生油中角鯊烯含量最高，為(477.20±10.31)mg/kg。

(4)熱榨花生油清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力最強(qiáng)，抗氧化性最好。