孫 廣 候貽莉 吳 輝 王 萍

(安順市人民醫(yī)院，安順561000)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜關(guān)節(jié)受累為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)疾病，多發(fā)生于雙手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)及足關(guān)節(jié)等[1]。流行病學研究表明，中國RA疾病發(fā)生率為0.32%～0.40%，隨著人口老齡化的增加，RA患病人數(shù)逐年增加，是導致殘疾的主要關(guān)節(jié)疾病之一[2]。目前臨床主要以延緩疾病進展，減輕關(guān)節(jié)炎癥為主，尚無根治RA疾病的治療策略。因此，盡早診斷出RA疾病有利于及時干預(yù)，減緩疾病發(fā)展，減少致殘情況的發(fā)生。研究表明，免疫細胞活性失衡、炎癥反應(yīng)、自身抗體生成等在RA疾病發(fā)生中具有重要作用[3]。既往研究表明，多種微小RNAs(Micro RNAs，miRNAs)對以上生物過程具有一定調(diào)控作用[4]。另外研究表明，外泌體攜帶的miRNA在一定程度上可反映其產(chǎn)生細胞的病理狀態(tài)，如在胰腺炎大鼠模型中，來自胰腺泡細胞的外泌體中包含大量調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的miRNAs，參與激活肺泡巨噬細胞，引起炎癥反應(yīng)[5]。因此，本研究通過檢測RA患者血清外泌體中miR-223、miR-155表達情況，并分析二者與RA患者臨床特征和炎癥因子水平的相關(guān)性，旨在揭示血清外泌體miR-223、miR-155表達在RA疾病發(fā)生發(fā)展中作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2015年4月～2017年8月在本院初診的RA患者77例為研究對象，其中男23例，女54例，年齡26～80歲，平均(50.23±9.85)歲，所有患者均進行28關(guān)節(jié)疾病活動性評分(Disease activity score in 28 joints，DAS28)，根據(jù)2010年歐洲抗風濕聯(lián)盟和美國風濕協(xié)會修訂的RA診斷標準[6]進行診斷，納入標準：①均符合上述RA診斷標準；②年齡26～80歲；③入院治療前未進行抗風濕藥物治療；④知悉本研究內(nèi)容并自愿加入；⑤依從性良好。排除標準：①排除合并其他自身免疫性疾病患者；②排除患有感染性疾病患者；③排除其他可能引起炎癥反應(yīng)疾病患者；④排除患有高血壓、糖尿病、肝腎疾病等患者。另選取同期在本院進行體檢的健康者75例為對照，其中男19例，女56例，年齡28～80歲，平均(49.78±9.35)歲。兩組受試者年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1資料采集 收集受試者年齡、性別一般資料和DAS28評分、抗環(huán)瓜氨酸多膚抗體(anti-cyclic peptide containing citrulline，anti-CCP)抗體、C反應(yīng)蛋白(Creaction protein，CRP)、紅細胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、類風濕因子(Rheumatoid factor，RF)等實驗室檢查指標。

1.2.2標本采集 分別于體檢當日和入院12 h內(nèi)采集體檢者和RA患者肘靜脈血(6 ml/人)，置于抗凝真空管中，取2 ml離心后保存上清，待測；剩余4 ml 采用外泌體試劑盒(德國QIAGEN公司)提取收集血清外泌體。

1.2.3檢測方法 采用ELX800自動酶標儀(美國BioTech公司)通過人腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號：ab181421，美國ABCam公司)、人白介素(Interleu-kin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號：ab46027，美國ABCam公司)、人IL-17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號：ab119535，美國ABCam公司)、人IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號：ab197447，美國ABCam公司)測定各受試者血清中TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β水平；采用外泌體RNA提取試劑盒(美國Life公司)提取血清外泌體總RNA，試劑盒富集miRNAs，以U6作為內(nèi)參，采用實時熒光定量(real-time fluorescence quantitative，qRT)-PCR技術(shù)檢測并分析血清外泌體中miR-223、miR-155表達。

2 結(jié)果

2.1兩組受試者臨床特征比較 RA組患者的性別、年齡與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；RA組患者的DAS28評分、抗CCP抗體水平、血清CRP水平、紅細胞沉降率、類風濕因子水平，見表1。

2.2血清外泌體miR-223、miR-155水平的比較 RA組患者血清外泌體miR-223、miR-155相對表達量均明顯高于對照組健康者(P<0.05)，見表2。

2.3血清外泌體miR-223、miR-155水平對RA疾病的診斷價值 ROC結(jié)果顯示，miR-223對RA疾病診斷的AUC為0.842(95%CI：0.754～0.931，P<0.05)，miR-223/U6≥3.53診斷RA疾病的敏感度為82.51%，特異度為78.56%，詳見圖1A；miR-155對RA疾病診斷的AUC為0.764(95%CI： 0.635～0.857，P<0.05)，miR-155/U6≥4.15診斷RA疾病的敏感度為61.83%，特異度為76.58%，詳見圖1B。

表1 兩組受試者臨床特征比較

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups of subjects

CharacteristicsRA groupControl groupt/χ2PGender(Male/Female)23/5419/560.3910.532Age(Year)50.23±9.8549.78±9.350.2890.773DAS28(Point)5.97±1.12046.1580.000Anti-CCP antibody(U/ml)213.59±42.57043.4480.000CRP(mg/L)16.37±3.450.34±0.0540.2310.000ESR(mm/h)36.75±9.7811.81±2.1421.5850.000RF(U/ml)437.27±73.56051.4760.000

表2 血清外泌體miR-223、miR-155表達的比較

Tab.2 Comparison of serum exosomes miR-223 and miR-155 expression

GroupsnmiR-223/U6miR-155/U6Control751.01±0.161.07±0.23RA773.46±0.734.08±0.79t-28.40631.711P-0.0000.000

圖1 血清外泌體miR-223、miR-155水平診斷RA疾病的價值Fig.1 Value of serum exosomes miR-223 and miR-155 in diagnosis of RA disease

表3 血清炎癥因子水平的比較

Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors levels

GroupsnTNF-α(pg/L)IL-6(ng/L)IL-17(ng/L)IL-1β(ng/L)Control756.87±1.371.46±0.2914.75±2.761.53±0.31RA7716.23±3.2513.48±2.5838.64±7.3920.18±3.94t-23.24240.62326.53341.409P-0.0000.0000.0000.000

表4 血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者臨床特征的相關(guān)性分析

Tab.4 Correlation between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and clinical features of RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPDAS280.5090.0000.5150.000Anti-CCP antibody0.5930.0000.5940.000CRP0.6020.0000.4970.000ESR0.6150.0000.6030.000RF0.5760.0000.5430.000

2.4兩組受試者血清炎癥因子水平的比較 檢測結(jié)果顯示，RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平均明顯高于對照組健康者(P<0.05)，見表3。

2.5血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者臨床特征的相關(guān)性 Pearson檢驗顯示，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者DAS28評分、血清抗CCP抗體、CRP、ESR、RF水平正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

2.6血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者血清炎癥因子水平的相關(guān)性 Pearson檢驗顯示，血清外泌體miR-223、miR-155水平均與RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相關(guān)(P<0.05)。

表5 血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者炎癥因子水平的相關(guān)性分析

Tab.5 Correlation analysis between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and inflammatory factor levels in RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPTNF-α0.5090.0000.5980.000IL-60.5860.0000.6110.000IL-170.6210.0000.6710.000IL-1β0.5540.0000.5840.000

3 討論

RA早期主要表現(xiàn)為滑膜炎，是關(guān)節(jié)病變的基礎(chǔ)，進一步發(fā)展可導致患者軟骨或骨組織損傷，甚至造成關(guān)節(jié)功能喪失，導致殘疾，嚴重影響患者身體健康和生活質(zhì)量。RA疾病早期表現(xiàn)為細胞浸潤性和滲出性，滑膜組織間質(zhì)出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，炎癥因子水平增加[7]。RA患者以30歲以上女性為主，涉及各個年齡段，隨著我國人口老齡化水平增加，RA發(fā)病率隨之逐年增加[8]。RA疾病發(fā)生時，患者關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)一定程度損傷，是導致殘疾的關(guān)節(jié)疾病之一，但其發(fā)病機制尚不明確。在疾病早期，采用非甾類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素等抗風濕類藥物處理可延緩疾病進展，改善患者癥狀，因此探究RA疾病發(fā)生機制，尋找合適生物指標，對RA疾病早期診斷和盡早治療具有重要意義。

外泌體是一類含有核酸、脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，由多種細胞產(chǎn)生，分泌進入循環(huán)系統(tǒng)的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，其中包含有miRNA、長鏈非編碼RNA等核酸類物質(zhì)，具有在細胞間傳遞信號的作用[9]。miRNAs可與目標基因mRNA 3′非編碼區(qū)進行特異結(jié)合，啟動目標基因mRNA降解或抑制目標基因轉(zhuǎn)錄翻譯，進而調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等生物學過程。隨著研究的深入，學者們發(fā)現(xiàn)miRNA參與自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生[10]。另外，被包裹在外泌體中的miRNAs可有效避免血清中RNA酶降解，可被完整傳遞給受體細胞，參與調(diào)解生理過程[11]。Gao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來源自樹突狀細胞的外泌體可作用于受體細胞膜TNF-α，激活NF-κB通路，增加動脈血管內(nèi)皮的炎癥程度，加重動脈粥樣硬化程度。近期研究表明，外泌體與RA疾病發(fā)病過程相關(guān)，通過將核酸等生物分子從供體細胞轉(zhuǎn)移至受體細胞，參與調(diào)控受體細胞內(nèi)信號通路并影響其功能[13]。基于以上研究結(jié)果，推測血清外泌體中miRNA表達可能作為潛在標志物用于RA疾病診斷。然而，目前關(guān)于RA患者血清外泌體miRNA表達模式的研究相對較少。

miR-223是一類哺乳動物常見的miRNA之一，存在于多種細胞、組織中，參與炎癥反應(yīng)等過程。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在RA患者血清中表達上調(diào)，參與破骨形成過程，動物實驗表明，抑制miR-223表達可有效降低關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)炎評分、組織學評分及骨組織侵蝕，表明抑制miR-223活性可能作為治療RA的策略。Shibuya等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-223在RA患者滑膜組織中高表達，細胞實驗表明，過表達miR-223可顯著促進破骨細胞生成，破骨細胞增多是RA疾病發(fā)生的原因之一，提示miR-223可能作為治療RA潛在靶點。以上研究表明，miR-223在RA患者血清及滑膜組織中均表達上調(diào)，參與RA疾病發(fā)生，但是關(guān)于RA患者血清外泌體中研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清外泌體中miR-223水平顯著高于對照者，與Filková等[16]在RA患者血清中發(fā)現(xiàn)一致，表明miR-223在RA患者血清外泌體及血清中均呈高表達，可能參與RA疾病發(fā)生。ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-223對RA疾病診斷的AUC為0.842，表明檢測血清外泌體miR-223水平可有效區(qū)分RA患者和健康者。另外，Elmesmari等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在RA患者外周血、單核細胞中表達均顯著高于對照組，可通過調(diào)節(jié)趨化因子和促炎癥趨化因子受體表達促進炎癥細胞聚集在關(guān)節(jié)滑膜，引發(fā)疾病。Alivernini等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-155在RA患者外周血B細胞中高表達，可促進滑膜組織中IL-21等炎癥因子表達，與滑膜組織炎癥嚴重程度有關(guān)，表明miR-155在RA疾病中是激活B細胞的重要調(diào)控因子。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清外泌體miR-155水平顯著高于對照者，與Rajasekhar等[19]在RA患者單核細胞和滑膜液中發(fā)現(xiàn)一致，表明血清外泌體miR-155表達上調(diào)可能參與RA疾病發(fā)生。ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-155對RA疾病診斷的AUC為0.764，表明檢測血清外泌體miR-155水平可有效區(qū)分RA患者和健康者。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者DAS28評分、血清抗CCP抗體、CRP、ESR、RF水平正相關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR-155與RA疾病進展有關(guān)。RA疾病是一種自身免疫性疾病，早期主要表現(xiàn)為病理性滑膜炎，研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的滑膜組織中聚集有大量巨噬細胞等，產(chǎn)生并分泌大量TNF-α、IL-6等炎癥因子進入循環(huán)系統(tǒng)，在RA疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[20]。與前人研究一致，本研究所納入RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平亦明顯高于對照者。進一步研究提示，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR-155可能通過調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β表達，參與RA疾病進展過程，這為進一步研究血清外泌體如何參與調(diào)節(jié)RA疾病發(fā)生和進展提供了一定思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-223、miR146a在RA患者血清外泌體中高表達，與患者疾病嚴重程度和血清炎癥因子水平有關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR146a高表達參與RA疾病發(fā)生。