冷 偉 劉春瑩 尚 乘 陳明霞

(陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,咸陽712000)

糖尿病腎病是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病的主要原因。據(jù)統(tǒng)計截至2015年，全球約有4.15億糖尿病患者，其中90%以上為2型糖尿病，推測每年有150～500萬人因糖尿病死亡，而糖尿病腎病是導致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。在1型糖尿病中糖尿病腎病的發(fā)病率為33%～40%，而2型糖尿病中發(fā)病率為20%～25%[2]。因此延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。糖尿病腎病發(fā)病機制與糖代謝紊亂、氧化應激、免疫調節(jié)和血流動力學異常等因素密切相關[3]。因此天然降血糖血脂、抗氧化化合物可以作為治療糖尿病腎病的候選藥物[4]。連翹苷是植物連翹干燥果實中的提取物，在生活中常用于清熱解毒、風熱感冒的治療。研究發(fā)現(xiàn)連翹苷具有抑制炎癥反應、抗病毒、抗氧化應激和細胞凋亡等多種藥理學作用[5,6]。Kong等[7]實驗顯示，連翹苷能抑制腫瘤壞死因子的激活，改善肥胖組織的炎癥變化和胰島素抵抗性。據(jù)報道，連翹苷能抑制高糖誘導的肝細胞脂肪積累，是腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活劑，具有預防和治療肥胖的作用[8]。然而連翹苷對糖尿病腎病腎組織是否具有保護作用尚未見報道。本實驗旨在探討連翹苷對糖尿病腎病腎損傷的保護作用，為連翹苷在糖尿病腎病中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 連翹苷(純度>98%，CAS：478-41-2)購自四川維克奇生物公司；SD大鼠購自北京維通利華實驗動物公司；蘇木伊紅染色試劑盒(HE)購自杭州昊鑫生物公司；大鼠尿白蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒購自上?？ㄅ锕荆淮笫驣L-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1 ELISA試劑盒購自武漢艾美捷科技公司；免疫組化試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗體TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin購自美國Abcam公司；SOD、CAT、GPx、MDA、GSSG、GSH檢測試劑盒購自碧云天生物。

1.2方法

1.2.1糖尿病腎病大鼠模型的復制 大鼠適應環(huán)境1周后，以高糖高脂飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、67.5%常規(guī)飼料)飼養(yǎng)1個月，誘導出胰島素抵抗。腹腔注射25 mg/kg鏈脲佐菌素，72 h后空腹狀態(tài)下大鼠血糖濃度高于16.7 mmol/L為造模成功。

1.2.2大鼠的分組及給藥 將糖尿病腎病大鼠隨機分為4組：糖尿病腎病組，連翹苷5 mg/kg組，連翹苷10 mg/kg組，連翹苷20 mg/kg組，另外設置正常對照組。造模成功后1 d，連翹苷5、10、20 mg/kg組大鼠采用灌胃給藥的方式給予連翹苷；糖尿病腎病組大鼠給予等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)2周后，檢測相應指標。

1.2.3蘇木伊紅染色 SD大鼠經水合氯醛腹腔注射麻醉后，用生理鹽水灌洗至腎臟變白。摘取腎臟液氮速凍后置于-80℃保存。取大鼠腎組織，4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟后，梯度降低的乙醇脫二甲苯，蘇木伊紅染色3 min，自來水洗1 min，1%氨水返藍，自來水洗1 min。95%乙醇1 min，伊紅染色30 s，80%乙醇脫水30 s，90%乙醇脫水30 s，95%乙醇脫水1 min，無水乙醇脫水1 min，二甲苯2 min后，更換新二甲苯2 min；中性樹脂封片。倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4生化指標的檢測 收集24 h尿液，4 000 g離心10 min，按照試劑盒說明書檢測尿白蛋白的含量。

大鼠麻醉后，眼眶取血，室溫靜置2 h，離心收集上清，使用全自動生化儀檢測血液尿素氮、尿素、肌酐的含量。取大鼠腎組織，預冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低溫勻漿，16 000 g離心10 min后，收集上清液。使用領聯(lián)茴香胺核黃素光化學反應法檢測大鼠腎組織中總SOD的活性；采用還原型谷胱甘肽消耗法檢測大鼠腎組織中GPx的活性；使用過氧化氫分解法檢測大鼠腎組織中CAT的活性；MDA采用硫代硫酸鈉法檢測；按照試劑說明書檢測大鼠腎組織中GSH和GSSG的含量。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠腎組織中炎癥因子的含量 取大鼠腎組織，預冷PBS洗3次，使用眼科剪剪碎后，低溫勻漿，16 000 g離心10 min后，收集上清液，生理鹽水稀釋后備用。取100 μl樣品至反應孔，設置標準樣品孔和空白孔，加檢測抗體，37℃孵育90 min，洗滌液洗5次，生物素標記的辣根過氧化物酶，37℃溫育30 min，洗滌液洗5次；加顯色液，37℃避光反應15 min，加終止液，檢測波長450 nm處吸收值。每個標本測3個復孔，測定值為3個復孔的平均值。

1.2.6免疫組化 取石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%過氧化氫于室溫下孵育10 min；切片置于盛枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，95℃左右持續(xù)10 min后室溫冷卻；PBS洗3次，5%BSA封閉液37℃孵育30 min；滴加一抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次；加生物素標記的抗體，37℃孵育30 min；PBS洗3 次，加SABC，37℃孵育30 min；PBS洗3次，顯微鏡下顯色并控制反應時間，蘇木素復染后脫水透明，中性樹膠封片。使用軟件Image J分析陽性細胞占比。

1.3統(tǒng)計學分析 使用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0分析實驗數(shù)據(jù)。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷的影響 實驗結果顯示，對照組腎小球上皮細胞排列整齊；糖尿病腎病組腎小球體積增大，系膜區(qū)彌漫性增寬，細胞外基質增多，基底膜增厚，腎間質有炎癥細胞浸潤。連翹苷治療后，腎小球的體積，基底膜厚度和炎癥細胞浸潤明顯減輕。

2.2連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎功能指標的影響 糖尿病腎病組與對照組相比，血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量顯著增加；糖尿病腎病大鼠經連翹苷作用后，結果顯示尿血液中尿素氮、肌酐、尿酸和24 h尿液中尿白蛋白的含量顯著減少，作用效果具有連翹苷劑量依賴效應，見圖2。

2.3連翹苷對糖尿病腎病大鼠炎癥反應的影響 實驗結果顯示，糖尿病腎病組與對照組相比，腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著升高；糖尿病腎病大鼠經連翹苷作用后，腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著降低，且作用效果具有連翹苷劑量依賴效應，見圖3。

圖1 蘇木伊紅染色檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷(×200)Fig.1 Effects of phillyrin on damage of forsythia glycos-ide to renal tissue in diabetic nephropathy rats was detected by hematoxylin and eosin staining(×200)

圖2 連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎功能指標的影響Fig.2 Effects of phillyrin on renal function in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠炎癥因子的影響Fig.3 Effect of forsythia glycoside on inflammatory factors in diabetic nephropathy rats was examined by enzyme-linked immunosorbent assayNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖4 免疫組化檢測連翹苷對糖尿病腎病大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin蛋白表達水平的影響(×400)Fig.4 Immunohistochemistry was used to determine effect of phillyrin on expression level of TGF-β1,Col-Ⅳ,Fibronectin related proteins in renal tissue of diabetic nephropathy rats(×400)Note: Compared with ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

圖5 連翹苷對糖尿病腎病大鼠氧化應激指標的影響Fig.5 Effects of phillyrin on oxidative stress in diabetic nephropathy ratsNote: Compared with Ctrl group，**.P<0.01；compared with DN group，##.P<0.01.

2.4連翹苷對糖尿病腎病大鼠TGF-β1通路相關蛋白表達水平的影響 實驗結果顯示，糖尿病腎病組與對照組相比，腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達水平顯著升高；糖尿病腎病大鼠經連翹苷處理后，腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達水平顯著降低，且其作用效果具有連翹苷劑量依賴效應，見圖4。

2.5連翹苷對糖尿病腎病大鼠氧化應激反應的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，糖尿病腎病組大鼠腎組織中總SOD、CAT、GPx的活性均顯著降低，MDA、GSSG的含量顯著增加，GSH的含量顯著降低；糖尿病腎病大鼠經連翹苷作用后，腎組織中總SOD、CAT、GPx的活性均顯著升高，MDA、GSSG的含量顯著降低，GSH的含量顯著升高，且其作用效果具有連翹苷劑量依賴效應，見圖5。

3 討論

隨著生活質量的提高，我國糖尿病的發(fā)病率呈上升的趨勢。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，目前治療效果只能在一定程度上控制其發(fā)展，緩解腎功能衰竭。研究發(fā)現(xiàn)降血壓、降血脂、抗血液凝聚藥物和抗氧化劑對糖尿病腎病患者腎臟具有保護作用[3]。許多重要提取物具有降血糖血脂和抗氧化等作用，Bo等[9]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過抑制脂質累積和氧化應激，對糖尿病腎病具有保護作用。連翹苷有抑制脂肪累積和抑制炎癥反應的作用，在此基礎上本實驗通過高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素誘導糖尿病腎病大鼠模型，探討連翹苷對DN大鼠腎臟的保護作用。

本實驗結果顯示連翹苷能有效緩解DN大鼠腎組織病理損傷，糖尿病腎病腎組織損傷與多種因素密切相關，如血流動力學改變、氧化應激、炎癥反應、細胞外基質的變化等。接下來從上述因素中探討連翹苷對DN大鼠中炎癥反應、氧化應激等因素的影響。

糖尿病腎病是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，典型的癥狀有尿白蛋白含量逐漸上升。本研究顯示，連翹苷治療糖尿病腎病大鼠后，大鼠血液中尿素氮、肌酐、尿酸的含量均顯著降低。尿酸是體內嘌呤代謝的終末產物，由腎臟排出，反映腎功能；肌酐反映腎臟的濾過能力；尿素氮也是腎功能觀測指標。腎小球和腎小管發(fā)生病變時，會出現(xiàn)尿白蛋白含量增加。實驗結果表明，連翹苷緩解糖尿病對大鼠腎功能的影響。

炎癥反應在DN的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。本實驗結果顯示，連翹苷處理DN大鼠后，大鼠腎組織中IL-4、IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、MCP-1的含量顯著降低。MCP-1是趨化因子家族中的重要成員，參與細胞外基質積累，能激活核因子κB刺激炎癥因子的釋放[10]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和IL-18促使腎組織腎小球基底膜增厚，增加血管的通透性。據(jù)報道，連翹苷通過抑制核因子κB的活性，緩解脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠的炎癥反應[11]。Yang等[12]在斑馬魚中也發(fā)現(xiàn)連翹苷具有抑制炎癥反應的作用。本實驗結果與上述研究一致，表明連翹苷抑制糖尿病腎病大鼠的炎癥反應。

TGF-β可以由多種細胞分泌，參與細胞生長、分化、免疫功能、組織修復和胚胎發(fā)育等過程的調節(jié)，TGF-β三種亞型中TGF-β1對糖尿病并發(fā)癥起主要的調節(jié)作用。在糖尿病患者和糖尿病動物模型中均發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達水平上調；臨床研究顯示抗TGF-β1抗體對糖尿病腎病患者有治療作用[13]。本文研究結果顯示，糖尿病腎病大鼠中TGF-β1的表達水平明顯高于對照組；糖尿病腎病大鼠經連翹苷處理后，大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達水平顯著降低。Col-Ⅳ、Fibronectin是細胞外基質中的主要蛋白，細胞外基質的積累是促進腎小球肥大的主要因素[14]。研究發(fā)現(xiàn)抑制TGF-β1的表達能有效抑制Col-Ⅳ、Fibronectin的積累。Wang等[15]實驗也證實，抑制TGF-β1通路能改善糖尿病腎病。連翹苷抑制DN大鼠腎組織中TGF-β1的表達水平，提示其作用與TGF-β1表達變化相關，而連翹苷具體的作用機制仍需要深入研究。

氧化應激是指機體受到有害刺激時氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡。研究發(fā)現(xiàn)血糖含量過高后，使ROS的含量上升，破壞腎小球基底膜的極性使腎小球濾過性遭破壞，另外通過改變血流動力學和細胞外基質，促進糖尿病腎病的發(fā)展[16]。本研究顯示，糖尿病腎病大鼠經連翹苷處理后，腎組織總SOD、CAT、GPx的活性均顯著升高，MDA、GSSG的含量顯著降低，GSH的含量顯著升高。SOD、CAT和GPx是抗氧化、清除氧自由基的關鍵蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，連翹苷能抑制過氧化氫誘導的神經細胞PC12的氧化應激和細胞凋亡，對細胞具有保護作用[5]。與本實驗結果一致，表明連翹苷抑制糖尿病腎病大鼠的氧化應激反應。

糖尿病腎病大鼠經連翹苷處理后，腎組織病變明顯緩解，腎功能有效提高，炎癥反應和氧化應激反應明顯緩解，大鼠腎組織中TGF-β1、Col-Ⅳ、Fibronectin的表達水平顯著降低。綜上所述，連翹苷對糖尿病腎病大鼠具有保護作用，其作用機制與抑制TGF-β1的表達相關。