胡根文，劉寶良，鐘淑媛，魏曉婷，鄒錦森，史凱寧，楊忠*

1.深圳市人民醫(yī)院（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院）放射科，廣東深圳 518000；2.深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院放射科，廣東深圳518000；3.飛利浦醫(yī)療科技，北京 100600； *通訊作者 楊忠 80250306@qq.com

梗阻性腎病是一種臨床綜合征，由于尿道結(jié)構(gòu)和（或）功能的改變而阻礙尿液排出，從而引起腎實(shí)質(zhì)病變和腎功能損害。腎間質(zhì)纖維化是梗阻性腎病最終的共同轉(zhuǎn)歸及主要的病理基礎(chǔ)[1]。嚙齒類動(dòng)物單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）是腎間質(zhì)纖維化的標(biāo)準(zhǔn)模型，已越來越多地應(yīng)用于研究[2]。磁共振動(dòng)脈質(zhì)子自旋標(biāo)記（arterial spin labeling，ASL）是一種非侵襲性功能MRI方法，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究，并顯示出良好的穩(wěn)定性。然而，因存在腹腔多器官所致的磁敏感偽影及呼吸運(yùn)動(dòng)偽影，ASL在腎臟的研究及應(yīng)用仍受到較大限制。

本研究通過分析梗阻性腎病-腎纖維化進(jìn)程中基于磁共振ASL的腎血流量（renal blood flow，RBF）變化，探討磁共振 ASL技術(shù)在早期檢測(cè)和評(píng)估梗阻性腎病-腎纖維化的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只雄性 SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（粵）2011-0015]，體重（200.0±20.5）g。保持室溫 18～20℃、濕度60%～70%、12 h晝夜交替的條件。使用蒸餾水和標(biāo)準(zhǔn)大鼠飲食喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中不限制飲用水和食物，定期記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況。所有研究人員均嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理規(guī)定。

采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為 6組，分別為梗阻前組及梗阻后1、2、3、4、5 d組，每組8只。模型組參考文獻(xiàn)[3]采用經(jīng)典UUO造模方法梗阻左側(cè)輸尿管及腎臟，以右腎作為對(duì)照組。模型制備方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠以3%戊巴比妥鈉2 ml/kg腹腔注射麻醉后行左側(cè)腹部切口打開腹腔，鈍性分離左側(cè)輸尿管，于中上1/3處以4-0絲線雙重結(jié)扎，分層縫合關(guān)閉腹腔。梗阻前組及梗阻后各組按預(yù)定時(shí)間麻醉后行MRI檢查。

1.2 MRI檢查 應(yīng)用Philips Ingenia 3.0T TX超導(dǎo)型MR掃描儀，以動(dòng)物線圈為接收線圈（線圈通道：4獨(dú)立通道；高分辨率成像范圍：F/H 80 mm、R/L 47 mm、A/P 47 mm）。大鼠以3%戊巴比妥鈉2 ml/kg腹腔注射麻醉后，頭先進(jìn)、俯臥位，使用腹帶以限制大鼠腹式呼吸。采用三維定位法定位。常規(guī)橫斷位掃描序列采用快速自旋回波序列（turbo spin echo，TSE），掃描范圍覆蓋腎臟。軸位TSE-T1WI：TR 400 ms、TE 10 ms、視野（FOV）60 mm×60 mm；矩陣120×93、層厚 4 mm；軸位TSE-T2WI：TR 1080 ms、TE 120 ms、FOV 60 mm×60 mm、矩陣120×88、層厚4 mm。

ASL序列采用基于回波平面成像的交替反轉(zhuǎn)恢復(fù)（flow-alternating inversion-recovery，F(xiàn)AIR）序列，自由呼吸，采集對(duì)照?qǐng)D和標(biāo)記圖數(shù)據(jù)，參數(shù)：TR 3000 ms、TE 35 ms、TI 1200 ms、FOV 60 mm×60 mm、矩陣76×58、層厚4 mm、NSA 10。使用后處理工作軟件獲得灌注圖。由2名放射科主治醫(yī)師手動(dòng)繪制腎臟感興趣區(qū)（ROI），獨(dú)立測(cè)量雙腎RBF 2次，取平均值。

1.3 腎臟組織病理學(xué)檢查 MRI檢查結(jié)束后處死大鼠并取出雙側(cè)腎臟。使用甲醛溶液固定、石蠟包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行 HE、Masson及 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組化染色檢查。由病理診斷專業(yè)主治醫(yī)師在不知MRI結(jié)果的情況下使用病理專用顯微鏡拍照評(píng)估。隨機(jī)選取大血管外的腎實(shí)質(zhì)視野（×200），釆用Image-Pro Plus v6.0圖像分析軟件分析α-SMA陽(yáng)性染色所占視野面積的百分比[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以±s表示。梗阻后各時(shí)間點(diǎn)左腎（梗阻側(cè)）與右腎（健側(cè)）計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；左腎（梗阻側(cè)）RBF與α-SMA陽(yáng)性面積的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 梗阻前雙側(cè)腎臟及梗阻后各組右腎（健側(cè)）腎小球大小均勻，形態(tài)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)僅存在于腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞；腎小球、腎小管及腎間質(zhì)均未見表達(dá)?；啄ぜ澳I間質(zhì)見極少量Masson染色（圖1）。

梗阻后1 d組梗阻側(cè)腎臟可見部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹；梗阻后3 d組梗阻側(cè)腎臟腎小管擴(kuò)張、腫脹更為明顯，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，腎間質(zhì)見少量Masson染色；梗阻后5 d組梗阻側(cè)腎臟可見部分腎小管萎縮、塌陷，腎間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)成分增加，纖維化形成，腎間質(zhì)纖維見較多Masson染色（圖1）。

梗阻后3 d組梗阻側(cè)腎臟腎間質(zhì)中α-SMA可見陽(yáng)性染色。隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎間質(zhì)中陽(yáng)性染色逐漸增多。梗阻后5 d組梗阻側(cè)腎臟腎小管上皮細(xì)胞可見α-SMA表達(dá)。梗阻前組及梗阻后1 d組左、右兩側(cè)腎臟 α-SMA陽(yáng)性面積占比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；梗阻后2、3、4、5 d組各組兩側(cè)腎臟α-SMA陽(yáng)性表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 磁共振 ASL-RBF變化趨勢(shì) 梗阻前組兩側(cè)腎臟RBF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。左腎（梗阻側(cè)）RBF均隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。梗阻后1 d組左腎（梗阻側(cè)）RBF較右腎（健側(cè)）明顯減低；梗阻5 d組梗阻側(cè)RBF均值相當(dāng)于對(duì)側(cè)的29.3%。梗阻后1、2、3、4、5 d組兩側(cè)腎臟RBF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 RBF與α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積的關(guān)系 α-SMA陽(yáng)性表達(dá)隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。梗阻后5 d組左腎（梗阻側(cè)）α-SMA陽(yáng)性面積比為（9.37±2.26）%，對(duì)側(cè)為（0.19±0.03）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。左腎（梗阻側(cè)）RBF與α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積呈負(fù)相關(guān)（r=-0.72，P<0.01）。

圖1 梗阻前組及梗阻后1、2、3、4、5 d組大鼠磁共振T2WI、ASL及病理學(xué)α-SMA染色、Masson染色圖（×200），梗阻后各組的左腎（梗阻側(cè)）逐步增大，且ASL顯示左腎（梗阻側(cè)）RBF逐步減低

表1 梗阻前組及梗阻后1、2、3、4、5 d組大鼠雙側(cè)腎臟磁共振ASL-RBF參數(shù)及病理學(xué)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積比的比較（±s）

表1 梗阻前組及梗阻后1、2、3、4、5 d組大鼠雙側(cè)腎臟磁共振ASL-RBF參數(shù)及病理學(xué)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)面積比的比較（±s）

分組 部位 影像學(xué)病理學(xué)腎血流量[ml/（100 g·min）]t值P值 α-SMA陽(yáng)性面積比（%）t值P值梗阻前 右側(cè)291.62±23.510.070.930.19±0.070.340.75左側(cè)292.36±16.540.18±0.06梗阻后1 d 右側(cè)291.58±15.958.44＜0.010.21±0.060.840.41左側(cè)187.33±31.030.18±0.07梗阻后2 d 右側(cè)312.37±28.6810.34＜0.010.21±0.068.81＜0.01左側(cè)174.83±24.011.24±0.31梗阻后3 d 右側(cè)292.33±22.2213.90＜0.010.20±0.088.81＜0.01左側(cè)111.54±30.032.56±0.98梗阻后4 d 右側(cè)294.32±26.9914.22＜0.010.21±0.059.68＜0.01左側(cè)91.44±29.935.89±0.16梗阻后5 d 右側(cè)293.57±39.9311.45＜0.010.19±0.0311.49＜0.01左側(cè)86.19±22.939.37±2.26

3 討論

UUO模型是研究梗阻性腎病-腎間質(zhì)纖維化的常用模型。該模型通過阻塞導(dǎo)致腎積水、腎盂壓力增加，從而降低腎灌注。一方面，腎小管供血減少，細(xì)胞缺氧，釋放大量氧自由基，加重上皮細(xì)胞的氧化損傷；另一方面，腎血流量減少導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率降低，引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化，促使間質(zhì)細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎小管萎縮，最終導(dǎo)致小管間質(zhì)纖維化。這一過程與人類腎臟間質(zhì)纖維化的過程類似。

病理學(xué)中，α-SMA常作為腎纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵指標(biāo)。α-SMA是細(xì)胞內(nèi)6種肌動(dòng)蛋白亞類之一，在所有真核細(xì)胞中的表達(dá)高度保守。它們沿微管組成細(xì)胞骨架的主要成分，代表血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，是肌成纖維細(xì)胞形成的標(biāo)志[5]。本研究采用 α-SMA 作為腎纖維化的指標(biāo)。

梗阻性腎病-腎纖維化病理分期可分為炎癥反應(yīng)期、纖維化形成期和瘢痕形成期。炎癥反應(yīng)期和纖維化形成早期經(jīng)過積極干預(yù)可延緩甚至逆轉(zhuǎn)患者向慢性腎衰竭的進(jìn)展，故早期診斷對(duì)指導(dǎo)臨床治療、改善患者腎功能、提高生活質(zhì)量具有重要意義[6]。

目前在臨床工作中，腎纖維化的診斷方法主要包括腎穿刺病理學(xué)活檢、血清學(xué)檢查及影像學(xué)檢查。腎穿刺活檢是診斷腎纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其為有創(chuàng)性檢查，不便于重復(fù)檢查及動(dòng)態(tài)觀察[7]。目前血清學(xué)標(biāo)志物的特異性和敏感性較低，限制了其在臨床上的常規(guī)應(yīng)用。常規(guī)影像學(xué)檢查在腎纖維化的診斷中價(jià)值有限。

隨著MRI硬件及技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，MR功能成像受到越來越多的關(guān)注。擴(kuò)散加權(quán)成像、ASL以及磁共振血氧水平依賴成像等功能性磁共振成像在腎臟病領(lǐng)域的研究具有良好的臨床應(yīng)用前景[8-9]；但其結(jié)果的準(zhǔn)確性仍有爭(zhēng)議[10]。

ASL通過磁化標(biāo)記內(nèi)源性血液有效量化評(píng)估器官的血流灌注信息。該技術(shù)既往應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究；但在腹部，特別是在腎臟的應(yīng)用仍有一定的限制。其原因主要為腎臟呼吸運(yùn)動(dòng)，多次采集數(shù)據(jù)可能出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)位移而影響擬合的準(zhǔn)確性。此外，腹部器官對(duì)磁場(chǎng)均勻度的影響減低了圖像信噪比。

本研究采用ASL-FAIR的標(biāo)記方法是以成像層面為中心進(jìn)行射頻激發(fā)，通過非選擇性脈沖將較大區(qū)域內(nèi)的血液進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，起到標(biāo)記動(dòng)脈血的效果。對(duì)照?qǐng)D則采用選擇性絕熱脈沖將局部區(qū)域內(nèi)的血液進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，經(jīng)過合理的TI，反轉(zhuǎn)血流被未反轉(zhuǎn)的新鮮血流完全代替而流出成像層面。最后將標(biāo)記圖像和對(duì)照?qǐng)D像代入相應(yīng)的模型中進(jìn)行計(jì)算，獲得相應(yīng)平面的灌注圖像，并測(cè)量得到RBF參數(shù)[11]。FAIR標(biāo)記法可較好地解決信噪比低及運(yùn)動(dòng)位移的情況。

目前在急性腎損傷、慢性腎病及移植腎中的研究，ASL均表現(xiàn)出與腎血流灌注及纖維化有較強(qiáng)的相關(guān)性[12-14]。本研究中，右腎（健側(cè)）RBF保持穩(wěn)定的趨勢(shì)，表明基于FAIR序列的ASL所獲得的腎臟RBF具有較好的穩(wěn)定性。而UUO梗阻后，腎臟RBF隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減低。這符合梗阻后腎臟的病理生理改變。同時(shí)，梗阻側(cè)的 RBF與病理學(xué)腎纖維化標(biāo)志物α-SMA陽(yáng)性表達(dá)具有較好的相關(guān)性。另外，梗阻后1 d組兩側(cè)腎臟RBF即有顯著差異，而此時(shí)病理學(xué)α-SMA尚未顯示差異，表明ASL可早期敏感地探測(cè)血流變化，有望應(yīng)用于各種腎臟病變的早期觀察及療效評(píng)估。

本研究的局限性為：因同位素檢查的限制，ASL所獲得的 RBF未能與“金標(biāo)準(zhǔn)”同位素檢查進(jìn)行對(duì)照；但既往研究表明，ASL所得RBF與參照標(biāo)準(zhǔn)具有良好的相關(guān)性[15]。本研究?jī)H測(cè)量腎門水平的 ASL信號(hào)，未能獲得腎臟上下極的數(shù)據(jù)。

總之，無創(chuàng)性磁共振 ASL灌注成像可以在不引入對(duì)比劑的條件下，在梗阻性腎病-腎纖維化疾病早期即顯示出較好的敏感性和穩(wěn)定性；但其在腎臟疾病中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步深入研究。