(長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025) (長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

由禽傳染性支氣管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的禽傳染性支氣管炎(Avianinfectiousbronchitis,IB)是一種高接觸性、急性的呼吸道傳染病,可導(dǎo)致不同日齡的雞發(fā)生不同程度的疾病[1]。IBV基因組RNA轉(zhuǎn)錄的不連續(xù)性以及RNA酶的不完全校對(duì)機(jī)制，使該病毒易于發(fā)生基因突變，導(dǎo)致該病毒的基因型、血清型復(fù)雜，各血清型之間僅有部分或者完全沒(méi)有交叉保護(hù)的作用[2]。因此，給該病的防控帶來(lái)了很大的困難，同時(shí)會(huì)造成養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。中藥方劑是目前治療IB的重要手段之一。劉振湘[4]、劉鵬飛[5]、王?；ǖ萚6]應(yīng)用中藥方劑治療雞傳染性支氣管炎，結(jié)果表明所使用的復(fù)方中草藥對(duì)于禽傳染性支氣管炎的治療有一定的作用。下面，筆者初步探討了香薷(Elsholtzia ciliata (Thunb.)Hyland.)的體外抗病毒方式，以期為抗IBV的中草藥開(kāi)發(fā)和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物的準(zhǔn)備

香薷購(gòu)自湖北省荊州市第一人民醫(yī)院中藥房。將購(gòu)來(lái)的香薷磨成粉末狀稱重，用一定體積的80%乙醇靜置浸泡7d以上，再用0.22μm直徑過(guò)濾器過(guò)濾除菌，樣品4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病毒及細(xì)胞

試驗(yàn)所用病毒為IBV-3ab-luc，是利用反向遺傳學(xué)技術(shù)在IBV的全基因組序列上采用熒光素酶luciferase的基因序列替代IBV的非功能基因3ab片段，使其能夠成功侵染人類(lèi)細(xì)胞系(H1299)，且其致病力和遺傳穩(wěn)定性均與IBV相近。該病毒能夠在感染細(xì)胞后，在其增殖過(guò)程中融合表達(dá)熒光素酶。

H1299細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞系)由新加坡南洋理工大學(xué)生物學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.1.3 儀器與試劑

主要試劑：二甲基亞砜(DMSO，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)、MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5二苯基四唑溴化物，北京索萊寶科技有限公司)、TRIZOL(賽默飛世爾科技有限公司)。

主要儀器：熒光檢測(cè)器(Promega公司)、PCR儀(BIO-RAD公司)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(SAN-YONG公司)。

1.1.4 PCR擴(kuò)增及引物序列

試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)用的檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)量引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度的測(cè)定

將所制得的香薷乙醇提取物用80%乙醇作溶劑進(jìn)行倍比稀釋，得到5個(gè)濃度梯度，分別為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL。在12孔板中用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H1299細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞覆蓋達(dá)到80%左右時(shí)，每孔加入稀釋好的香薷乙醇提取物6μL，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，去掉上清，重新加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基1mL，每孔200μL培養(yǎng)基加入20μL MTT，濃度為5mg/mL，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4h后，吸出上清液，每孔加入500μL DMSO，待形成的甲臜(Formazan)充分溶解于DMSO后，用酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處測(cè)出每孔光密度值。

1.2.2 不同處理方式下香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響試驗(yàn)

病毒感染采用3種方式進(jìn)行處理。

方式1：在12孔板中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待H1299細(xì)胞達(dá)到80%左右時(shí)，再加入實(shí)驗(yàn)測(cè)得的最大無(wú)毒濃度的香薷乙醇提取物6μL，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后去掉每孔上清，重新加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液1mL，再加入IBV-3ab-luc 100μL感染。感染24h后按照文獻(xiàn)[7]的方法檢測(cè)熒光值。

方式2：在12孔板中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋度達(dá)到100%時(shí)，去掉上清，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液1mL，加入100μL IBV-3ab-luc感染細(xì)胞，感染16h后，加入最大無(wú)毒濃度的香薷乙醇提取物6μL，再進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后按照文獻(xiàn)[7]的方法檢測(cè)熒光值。

方式3：在12孔板中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋度達(dá)到95%以上時(shí)，去掉上清，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液1mL，在EP管中將100μL IBV-3ab-luc與6μL香薷乙醇提取物在室溫環(huán)境中充分混合，再進(jìn)行感染。感染24h后按照文獻(xiàn)[7]的方法檢測(cè)熒光值。

每種方式3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。

將對(duì)照組的熒光值與各處理的熒光值的比值(N)的數(shù)量級(jí)數(shù)lgN作為抑制效力參考指標(biāo)，N值越大表明抑制效力越強(qiáng)[8]。

1)不同濃度的香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響 將香薷乙醇提取物用80%乙醇梯度稀釋為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL 5個(gè)不同的濃度，采用上述方式3進(jìn)行處理，每組3個(gè)重復(fù)，感染24h后按文獻(xiàn)[7]的方法檢測(cè)熒光值。

2)不同培養(yǎng)時(shí)間下香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響 在12孔板中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后采用上述方式3進(jìn)行處理，加入100μL IBV-3ab-luc和6μL 香薷乙醇提取物混合物，做3個(gè)重復(fù)，設(shè)置時(shí)間梯度，分別培養(yǎng)4、8、12、16、24h后去除上清，取適量PBS清洗每孔，再加入100μL RLB用槍頭充分刮下細(xì)胞后凍融一次并檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間下的熒光值，以反映病毒的增殖情況。每組梯度設(shè)置對(duì)照，培養(yǎng)不同時(shí)間后檢測(cè)熒光值。

1.2.3 香薷乙醇提取物對(duì)感染IBV的細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因表達(dá)量的影響試驗(yàn)

在6孔板中培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，去除上清，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液2mL，再接入200μL IBV-3ab-luc，37℃培養(yǎng)24h，作為對(duì)照。另外一個(gè)6孔板上培養(yǎng)H1299細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋達(dá)到95%以上時(shí)，去除上清，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液2mL，采用上述方式3進(jìn)行處理，在EP管中將100μL IBV-3ab-luc與6μL香薷乙醇提取物在室溫環(huán)境中充分混合，再接入200μL IBV-3ab-luc進(jìn)行感染，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照文獻(xiàn)[9]的方法提取總RNA后進(jìn)行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度的確定

注：CK為未加藥的空白對(duì)照; ns表示與對(duì)照組比較P>0.05，** 表示P<0.01。 圖1 不同濃度香薷乙醇提取物處理細(xì)胞后的光密度

圖1結(jié)果表明，當(dāng)提取物濃度為0.01875、0.0375、0.075、0.15g/mL時(shí)，其光密度與對(duì)照組相比較差異不顯著(P>0.05)，表明各濃度提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。當(dāng)提取物濃度為0.3g/mL其光密度值小于其他提取物濃度的光密度值，且差異顯著(P<0.05)，表明該濃度提取物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)存在抑制作用，因此將提取物濃度0.3g/mL確定為香薷乙醇提取物作用于H1299細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度。

2.2 不同處理方式下香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響

表2結(jié)果表明，3種病毒感染方式下香薷乙醇提取物對(duì)病毒增殖都有不同程度的抑制效果。方式1和方式2對(duì)病毒增殖有抑制效果，方式3對(duì)病毒增殖的抑制效果最顯著。

表2 香薷乙醇提取物不同處理方式下IBV-3ab-luc增殖量的熒光值

注：比值(N)為對(duì)照組的熒光值與各處理的熒光值的比值。

2.2.1 不同濃度香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響

圖2結(jié)果表明，采用方式3處理，當(dāng)香薰提取物濃度為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL時(shí)，這5種濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用。藥物濃度越高，檢測(cè)到的熒光值越低，說(shuō)明藥物對(duì)病毒的增殖的抑制作用越明顯；反之，檢測(cè)到的熒光值越高，說(shuō)明藥物對(duì)病毒的增殖的抑制作用越不明顯。因此，香薷乙醇提取物抑制IBV增殖的效果與其濃度成正相關(guān)關(guān)系。

2.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間下香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的影響

圖3結(jié)果表明，采用香薷乙醇提取物與病毒混合感作處理，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物對(duì)IBV增殖的抑制效果越顯著，說(shuō)明香薷乙醇提取物對(duì)IBV增殖的抑制作用與作用時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。

注：CK為未加藥的空白對(duì)照;*** 表示與 注: CK為未加藥的空白對(duì)照,0.3g/mL代表加藥濃度為 對(duì)照組比較,P<0.001。 0.3g/mL。*** 表示與對(duì)照組比較， P<0.001。 圖2 不同濃度香薷乙醇提取物處理病毒 圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間下香薷乙醇提取物處理病毒 感染細(xì)胞后IBV-3ab-luc的熒光值 感染細(xì)胞后IBV-3ab-luc的熒光值

2.3 香薷乙醇提取物對(duì)感染IBV的細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因表達(dá)量的影響

由圖4和圖5可以看出，在病毒感染方式3下，香薷乙醇提取物能夠促進(jìn)感染IBV細(xì)胞抗病毒基因的表達(dá)，從而抑制IBV在細(xì)胞內(nèi)的增殖。

注： 2、5分別為IBV侵染細(xì)胞后SOCS3、STAT1的表達(dá)；3、6分別為用香薷乙醇提取物處理病毒感染的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因SOCS3、STAT1的表達(dá)；1、4為陽(yáng)性對(duì)照。圖4 不同處理下的H1299細(xì)胞中SOCS3、STAT1的表達(dá)

3 討論

傳統(tǒng)疫苗的廣泛使用并未使IB得到有效控制，主要原因是不同基因型或血清型毒株的存在和新變異毒株的不斷出現(xiàn)，而現(xiàn)有的疫苗大多只對(duì)同型毒株提供有效的交叉保護(hù)而對(duì)異型毒株的保護(hù)效果差，甚至完全無(wú)效。使用化學(xué)合成的抗病毒藥物防治IB，在抑制或殺滅病毒時(shí)，往往給宿主細(xì)胞造成一定程度的損傷，同時(shí)還存在易產(chǎn)生耐藥性和發(fā)生藥物殘留等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，許多中草藥不僅具有抑制、消除炎癥的功效，還能有效修復(fù)受損組織，發(fā)揮鎮(zhèn)痛、解毒之功效，同時(shí)有助于機(jī)體增強(qiáng)抗應(yīng)激能力，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)活動(dòng)，強(qiáng)化腦垂體功能，因而可利用中草藥來(lái)防治雞傳染性支氣管炎[10]。我國(guó)有著豐富的植物資源，藥用植物種類(lèi)豐富，而現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，植物中含有豐富的抗病毒成分，是抗病毒研究的好材料。

注： 2、5分別為IBV侵染細(xì)胞后IFN-β、OASL的表達(dá)；3、6分別為用香薷乙醇提取物處理病毒感染的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因IFN-β、OASL的表達(dá)；1、4為陽(yáng)性對(duì)照。 圖5 不同處理下的H1299細(xì)胞中IFN-β、OASL的表達(dá)

香薷是一種應(yīng)用較多的中藥，屬唇形科香薷屬的一年生草本植物。其性溫、味辛，具有解熱、消炎、解痙、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等優(yōu)良作用[11]。從香薷中提取鑒定的包括揮發(fā)油在內(nèi)的成分，總共達(dá)到了100多種，其中主要的化合物成分是黃酮和香豆素[12]。黃酮類(lèi)化合物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及增強(qiáng)免疫力的作用[13]。應(yīng)國(guó)紅等[14，15]，以乙型肝炎病毒(HBV)為對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)香薷水提取物對(duì)其有明顯的抑制作用，后來(lái)通過(guò)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的方法，又發(fā)現(xiàn)其對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)也有明顯的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)香薷乙醇提取物的3種處理方式均能對(duì)IBV在細(xì)胞內(nèi)的增殖起到一定的抑制作用，以香薷乙醇提取物與病毒混合感作后加入對(duì)IBV的抑制效果最明顯。濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，香薷乙醇提取物對(duì)IBV的抑制效果與其濃度成正比，濃度越高，對(duì)抑制IBV增殖的效果越明顯。時(shí)間梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，藥物對(duì)IBV增殖的抑制效果有一定的時(shí)間依賴性，隨之藥物處理時(shí)間的增加，對(duì)IBV的抑制效果越明顯。

IBV感染細(xì)胞后會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，同時(shí)也會(huì)激活細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，IBV也可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通道促進(jìn)病毒的復(fù)制，從而引起免疫逃避作用[16,17]。為了進(jìn)一步了解香薷抗IBV的作用機(jī)制，本研究通過(guò)RT-PCR的方法，檢測(cè)了香薷乙醇提取物處理IBV感染的細(xì)胞后3種抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表達(dá)量，與對(duì)照組相比，使用香薷乙醇提取物處理感染IBV的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表達(dá)量均有提升。SOCS3、OASL、STAT1為干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的細(xì)胞因子。干擾素是一類(lèi)糖蛋白，它具有高度的種屬特異性，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤作用，在宿主抗病毒應(yīng)答中具有重要作用，它能夠激活細(xì)胞中多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮各種生物學(xué)功能，其中JAK-STAT途徑為抗病毒過(guò)程中最主要的途徑，它還可通過(guò)調(diào)節(jié)宿主獲得性免疫功能，間接清除病毒[18]。本研究結(jié)果說(shuō)明香薷乙醇提取物可以通過(guò)調(diào)控干擾素途徑，增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)，從而抑制病毒的增殖。香薷的成分比較復(fù)雜，且不同的有效成分會(huì)作用于不同的靶點(diǎn)和不同的環(huán)節(jié)從而產(chǎn)生多種藥理作用，但香薷對(duì)IBV的抑制作用是其中具體哪一種或哪幾種有效成分發(fā)揮抗病毒作用以及如何發(fā)揮抗病毒作用，還有待進(jìn)一步研究。