梁宇明，何燕

骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑（BAMBI）是一種高度保守的跨膜蛋白，廣泛存在于心肌細(xì)胞，與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)密切相關(guān)。研究表明，BAMBI是TGF-β信號(hào)通路的偽受體，可負(fù)調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制TGF-β的表達(dá)［1］，而TGF-β與器官纖維化關(guān)系密切，是公認(rèn)的器官纖維化治療靶標(biāo)［2］。VILLAR等［3］研究結(jié)果顯示，心臟壓力超負(fù)荷患者心臟組織中BAMBI表達(dá)水平高于正常人群；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，心臟壓力超負(fù)荷小鼠心肌組織中BAMBI表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)抑制TGF-β的表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，維持血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷“平衡”，進(jìn)而保護(hù)心臟功能。高血壓可使心臟處于壓力超負(fù)荷狀態(tài)，導(dǎo)致心肌纖維化，進(jìn)而增加心房顫動(dòng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，BAMBI可通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)心肌組織中TGF-β的表達(dá)而在一定程度上減輕壓力超負(fù)荷狀態(tài)下的心肌纖維化［4］。本研究旨在觀察自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達(dá)情況，并分析其與心房顫動(dòng)易感性的關(guān)系，以期為高血壓并心房顫動(dòng)的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年8月—2019年4月，選取8只14周齡清潔級(jí)Wistar大鼠作為對(duì)照組，8只14周齡清潔級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠作為觀察組，體質(zhì)量300～350 g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。兩組大鼠均飼養(yǎng)至22周齡，飼養(yǎng)環(huán)境如下：溫度16～25 ℃，每籠4只大鼠，以普通干飼料喂養(yǎng)，不限飲水，光照-黑暗每12 h交替1次。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)

精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)可能降低直接下調(diào)TGF-β表達(dá)所致不良反應(yīng)發(fā)生率，本研究以TGF-β的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子—心肌組織骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑（BAMBI）為切入點(diǎn)，初步探討了自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達(dá)情況及其與心房顫動(dòng)易感性的關(guān)系研究，有可能成為臨床防治高血壓并心房顫動(dòng)的新思路。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 無(wú)水乙醇和二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），檸檬酸（pH值為6.0）抗原修復(fù)液、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液及DAB顯色試劑（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產(chǎn)），BAMBI一抗、TGF-β1一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（Abcam公司生產(chǎn)）。

1.2.2 主要儀器 智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)（北京軟隆生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：BP-2010A），生物信號(hào)采集儀器（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：MD3000），彩色多普勒B超儀（意大利百勝公司生產(chǎn)，型號(hào)：MyLabSeven），脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：JJ-12J），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：JB-P5），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：RM2016），脫色搖床（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：TSY-B），渦旋混合器（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：MX-F），免疫組化筆（Gene Tech公司生產(chǎn)，型號(hào)：GT1001），顯微鏡（CIC公司生產(chǎn)，型號(hào)：XSP-C204）。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 體質(zhì)量、收縮壓（SBP）及心率 飼養(yǎng)至22周齡時(shí)檢測(cè)兩組大鼠體質(zhì)量；采用智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)檢測(cè)大鼠SBP及心率，檢測(cè)時(shí)間固定為9:00～14:00，每只大鼠在安靜狀態(tài)下檢測(cè)3次并取平均值，其中Wistar大鼠SBP≤140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、自發(fā)性高血壓大鼠SBP≥160 mm Hg為滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.3.2 左心結(jié)構(gòu)指標(biāo)及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF） 飼養(yǎng)至22周齡時(shí)，兩組大鼠均采用10%水合氯醛行腹腔注射誘導(dǎo)麻醉，剔除頸部、胸部毛，采用彩色多普勒B超儀于左胸骨旁取左心長(zhǎng)軸和左心室乳頭肌短軸切面檢測(cè)左心房前后徑、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）及LVEF。

1.3.3 心房顫動(dòng)誘發(fā)情況 完成彩色多普勒B超儀檢查后進(jìn)行心房顫動(dòng)誘發(fā)試驗(yàn)：取大鼠左側(cè)胸部備皮，仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，采用MD3000生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄其Ⅱ?qū)?lián)心電圖，具體如下：首先將食管電極（頭端設(shè)計(jì)有2個(gè)直徑為1 mm的環(huán)狀電極，兩個(gè)電極之間間隔2 mm）順著食管方向插入，調(diào)搏電極尾端接入生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)以捕獲食管心電圖；然后將食管電極定位于左心房位置，撤掉電極尾端食管心電圖感應(yīng)器并接入正負(fù)電極夾，連接生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)并選擇電刺激模式，按下刺激按鈕，采用脈沖波開(kāi)始起搏大鼠左心房；電刺激參數(shù)：脈沖波電壓2 V，電流50 Hz，每次刺激時(shí)間為30 s，間隔5 min后行下一次刺激，重復(fù)3次。心房顫動(dòng)誘發(fā)成功的標(biāo)志為大鼠體表心電圖P波消失，代以典型的f波、RR間期不等［5］。

1.3.4 心肌纖維化情況 飼養(yǎng)至22周齡時(shí)處死所有大鼠并取出心臟，采用Masson染色法觀察大鼠心肌纖維化情況，具體如下：心臟組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，切片，厚度為4～5 μm，蘇木素染色5～10 min，Masson復(fù)合染色5～10 min，苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min，1%冰醋酸水處理1 min，95%乙醇多次脫水，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變，其中藍(lán)色部分代表心肌纖維化。

1.3.5 BAMBI、TGF-β1表達(dá)情況 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，采用免疫組化染色法定性、定量觀察心肌組織BAMBI、TGF-β1表達(dá)情況，具體如下：（1）抗原修復(fù)：采用檸檬酸抗原修復(fù)液將切片進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后將玻片置于PBS中并在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，5 min/次；（2）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH值為7.4）中并在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，5 min/次；（3）血清封閉；（4）加BAMBI或TGF-β1一抗；（5）加山羊抗兔IgG二抗；（6）加DAB顯示試劑顯色；（7）復(fù)染細(xì)胞核：蘇木素復(fù)染約3 min后自來(lái)水沖洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒后自來(lái)水沖洗，蘇木素返藍(lán)液返藍(lán)后流水沖洗；（8）脫水封片；（9）顯微鏡鏡檢；（10）蘇木素復(fù)染，細(xì)胞核為藍(lán)色，BAMBI、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色。之后采用Image J軟件定量分析心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量，具體如下：（1）打開(kāi)需要測(cè)量平均光密度的圖片；（2）圖片反色；（3）校正光密度；（4）選擇測(cè)量單位；（5）選擇測(cè)量項(xiàng)目；（6）選擇測(cè)量閾值；（7）點(diǎn)擊Measure進(jìn)行測(cè)量，讀出平均光密度值即為BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，體質(zhì)量、SBP、心率、BAMBI及TGF-β1相對(duì)表達(dá)量為符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以（x ±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、SBP及心率 兩組大鼠體質(zhì)量和心率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組大鼠SBP高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表1）。

2.2 左心結(jié)構(gòu)指標(biāo)及LVEF 觀察組大鼠左心房前后徑、LVESD大于對(duì)照組，LVEF低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組大鼠LVEDD比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2、圖1）。

表1 兩組大鼠體質(zhì)量、SBP及心率比較（x±s）Table 1 Comparison of body mass，SBP and heart rate between the two groups

表2 兩組大鼠左心結(jié)構(gòu)指標(biāo)及LVEF比較（x±s）Table 2 Comparison of indicators of left ventricular structure and LVEF between the two groups

2.3 心房顫動(dòng)誘發(fā)成功率 對(duì)照組大鼠心房顫動(dòng)誘發(fā)成功率為37.5%（9/24），觀察組大鼠為70.8%（17/24）；觀察組大鼠心房顫動(dòng)誘發(fā)成功率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.371，P＜0.05）。原發(fā)性高血壓大鼠心房顫動(dòng)誘發(fā)成功心電圖表現(xiàn)見(jiàn)圖2。

2.4 心肌纖維化情況 Masson染色結(jié)果顯示，觀察組大鼠心肌纖維化程度重于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。

圖1 彩色多普勒B超儀檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Color Doppler B-mode ultrasound examination results

圖2 原發(fā)性高血壓大鼠心房顫動(dòng)誘發(fā)成功心電圖表現(xiàn)Figure 2 ECG performance in SHR with successful induction of atrial fibrillation

圖3 兩組大鼠心肌組織病理學(xué)改變（Masson染色，×200，高清彩圖掃本文OSID碼）Figure 3 Pathological changes of myocardial tissue in the two groups

2.5 BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量 觀察組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3、圖4）。

2.6 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量間無(wú)直線相關(guān)關(guān)系（r=0.185，P=0.661，見(jiàn)圖5）。

表3 兩組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative expression quantity of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue between the two groups

圖5 自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量間相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 5 Scatter plot for correlation between relative expression quantity of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue in SHR

圖4 兩組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達(dá)情況（免疫組化染色，×200，高清彩圖掃本文OSID碼）Figure 4 Expressions of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue in the two groups

3 討論

心房顫動(dòng)是臨床常見(jiàn)且危害較大的心律失常類型之一，具有較高的病死率［6］。目前國(guó)內(nèi)外研究均表明，高血壓是心房顫動(dòng)的重要危險(xiǎn)因素之一［7-8］；心房顫動(dòng)可導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高5倍［9］，而高血壓繼發(fā)的心房顫動(dòng)可導(dǎo)致心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯升高［10］，因此探究高血壓繼發(fā)心房顫動(dòng)的具體機(jī)制對(duì)高血壓并心房顫動(dòng)的防治至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠左心房前后徑、LVESD大于對(duì)照組，心房顫動(dòng)誘發(fā)成功率高于對(duì)照組，纖維化程度重于對(duì)照組，提示自發(fā)性高血壓大鼠心房顫動(dòng)易感性增加，分析其原因可能如下：高血壓導(dǎo)致心臟長(zhǎng)期處于壓力超負(fù)荷狀態(tài)，左心室心肌肥厚及順應(yīng)性、舒張功能下降，進(jìn)而使左心房壓力負(fù)荷增加及左心房擴(kuò)大，壓力負(fù)荷持續(xù)存在可進(jìn)一步引起左心房重構(gòu)尤其是左心房心肌纖維化，而左心房重構(gòu)是心房顫動(dòng)的病理基礎(chǔ)，因此左心房纖維化程度越重則心房顫動(dòng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高［11-12］。本研究結(jié)果顯示，兩組大鼠LVEF雖均在參考范圍，但觀察組大鼠LVEF低于對(duì)照組，提示自發(fā)性高血壓大鼠左心室結(jié)構(gòu)改變?cè)谝欢ǔ潭壬嫌绊懥俗笮氖沂湛s功能。本研究結(jié)果還顯示，兩組大鼠LVEDD比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示22周齡自發(fā)性高血壓大鼠尚未進(jìn)展至收縮功能失代償期。

TGF-β是一個(gè)分泌型多肽信號(hào)分子，屬于TGF-β超家族成員，共包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4及TGF-β5五種亞型［13］。目前在哺乳動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1在體細(xì)胞系中占比最高、分布最廣泛、生物活性最強(qiáng)［14-15］。既往研究表明，自發(fā)性高血壓大鼠左心房組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)［16］；周飛等［17］研究表明，血清TGF-β1水平可預(yù)測(cè)陣發(fā)性心房顫動(dòng)進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，觀察組大鼠心肌組織TGF-β1相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，推測(cè)自發(fā)性高血壓大鼠血壓持續(xù)升高導(dǎo)致心肌組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化、左心房重構(gòu)并增加心房顫動(dòng)易感性。

ZHAO等［18］經(jīng)快速心房起搏構(gòu)建持續(xù)性心房顫動(dòng)兔模型，結(jié)果表明，氯沙坦可通過(guò)抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路而減輕心肌纖維化，降低心房顫動(dòng)誘發(fā)成功率。張飛龍等［16］研究發(fā)現(xiàn)，螺內(nèi)酯可降低自發(fā)性高血壓大鼠左心房TGF-β1的表達(dá)，減輕心肌纖維化程度，進(jìn)而降低心房顫動(dòng)發(fā)生率。GIANNETTA等［19］研究發(fā)現(xiàn)，西地那非能有效降低糖尿病心肌病患者血TGF-β水平，改善患者左心室收縮功能。因此，通過(guò)調(diào)控TGF-β1表達(dá)而干預(yù)心肌纖維化成為近年臨床研究熱點(diǎn)；但BIERIE等［20］研究表明，直接下調(diào)TGF-β的表達(dá)可引發(fā)較多不良反應(yīng)，分析其原因可能與未精準(zhǔn)調(diào)控TGF-β的表達(dá)有關(guān)。

BAMBI是TGF-β的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，在心臟壓力超負(fù)荷狀態(tài)下，心肌組織BAMBI表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)而減輕心肌纖維化，進(jìn)而保護(hù)心臟功能［3］。本研究初步探討了自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI表達(dá)情況及其與TGF-β1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，觀察組大鼠心肌組織BAMBI相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示自發(fā)性高血壓大鼠壓力負(fù)荷引起心肌組織TGF-β1表達(dá)上調(diào)的同時(shí)亦上調(diào)了BAMBI的表達(dá)，但BAMBI可抑制TGF-β1的表達(dá)，進(jìn)而在一定程度上拮抗TGF-β1表達(dá)上調(diào)所致的心房顫動(dòng)易感性增加。因此，調(diào)控自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI的表達(dá)可能實(shí)現(xiàn)對(duì)TGF-β1表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控，進(jìn)而降低心房顫動(dòng)易感性。

本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI和TGF-β1相對(duì)表達(dá)量間無(wú)直線相關(guān)關(guān)系，分析其原因可能與BAMBI的表達(dá)還受到其他因子調(diào)控有關(guān)。劉鐵成等［21］研究表明，TGF-β1可預(yù)測(cè)復(fù)律后心房顫動(dòng)恢復(fù)情況；但夏時(shí)俊［22］研究表明，血清TGF-β1水平對(duì)心房顫動(dòng)射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值有限。因此，應(yīng)進(jìn)一步尋求對(duì)心房顫動(dòng)預(yù)測(cè)價(jià)值較高的臨床指標(biāo)。VILLAR等［3］研究表明，壓力超負(fù)荷情況下心肌組織BAMBI表達(dá)上調(diào)，因此其可能較TGF-β1能更敏感地預(yù)測(cè)心房顫動(dòng)的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，22周齡自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織BAMBI和TGF-β1表達(dá)上調(diào)，其中TGF-β1表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致心肌纖維化加重，左心房重構(gòu)，進(jìn)而增加心房顫動(dòng)易感性；而B(niǎo)AMBI表達(dá)上調(diào)可在一定程度上拮抗自發(fā)性高血壓大鼠因TGF-β1表達(dá)上調(diào)所致心房顫動(dòng)易感性增加，可能成為臨床防治高血壓并心房顫動(dòng)的新思路。但本研究未對(duì)BAMBI的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，下一步將利用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默和過(guò)表達(dá)BAMBI而探究BAMBI對(duì)TGF-β信號(hào)通路的影響，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果結(jié)論。

作者貢獻(xiàn)：梁宇明進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集、整理、分析，結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；何燕負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。