房國梁 趙杰修 張漓 李良 李鵬飛

國家體育總局體育科學研究所（北京100061）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種多發(fā)于老年人，以進行性認知功能障礙和記憶力衰退為主要臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。該病最為典型的病理學特征為腦內(nèi)老年斑（senile plaque，SP）的出現(xiàn)[2]、神經(jīng)纖維纏結（neurofbrillary tangles，NFTs）的形成[3]以及神經(jīng)元的大量丟失[4]等。

研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）∕蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB∕Akt）信號通路能夠調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡，在AD發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[5]。PI3K由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85 組成。p110 亞基能夠催化4，5 二磷酸肌醇（phosphatidylinositol-3，4-bisphosphate，PIP2）生成3，4，5三磷酸肌醇（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）[6]。生成的PIP3 招募磷酸肌醇依賴激酶1（phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1）和Akt 至細胞膜，促使PDK1 磷酸化Akt Thr308 位點[7]，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）磷酸化Akt Ser473 位點[8]，完全激活Akt[9]。活化的Akt 可以磷酸化Bcl-2 相關促凋亡蛋白（Bcl-2 associated death promoter，Bad）Ser112∕136位點[10]、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）Ser184位點[11]，從而有效阻斷Bad、Bax誘導的細胞凋亡?；罨腁kt 還可以阻止含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）和Caspase-9的活化[12]，促進p53的失活[13]，阻止線粒體細胞色素C（Cytochrome C）的釋放[14]，從而起到抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。

大量研究表明，長期有規(guī)律的體育運動能夠有效延緩AD的發(fā)生，但其機制尚不明確。我們在前期的研究中已發(fā)現(xiàn)有氧運動能夠提高普通大鼠和肥胖大鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織PI3K∕Akt通路活性[15，16]，并且有氧運動對抑制神經(jīng)細胞凋亡有積極作用[16]。但是有氧運動是否通過激活PI3K∕Akt 通路調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡，目前國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究利用PI3K∕Akt 特異性抑制劑GNE-317 抑制APP∕PS1 轉基因小鼠腦中PI3K∕Akt信號通路活性，觀察8周有氧運動后小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中各細胞凋亡因子的變化情況，以揭示有氧運動抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用機制，為闡明有氧運動延緩AD發(fā)生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)及分組

40 只8月齡 雄 性APP∕PS1 轉基 因 小鼠，體 重 為30.15 ± 3.43 g，購自中科澤晟生物科技有限公司。每籠2 只小鼠，自由進食飲水，光照比為12 h∶12 h，溫度20℃± 2 ℃，相對濕度40%～60%。在適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為4 組，安靜組（T-SE，n=10）、運動組（T-EX，n=10）、GNE-317處理安靜組（T-SEG，n=10）和GNE-317處理運動組（T-EXG，n=10）。

1.2 訓練方案

所有小鼠先進行5 天的跑臺適應性訓練，每天訓練10 min，速度9 m∕min。休息2 天后，T-EX 和TEXG 組小鼠按表1中的方案進行為期8 周的正式訓練。在8 周時間內(nèi)跑臺速度從12 m∕min 增至15 m∕min，通過動物氣體代謝分析系統(tǒng)測定相當于74%～79% VO2max 負荷強度，訓練時間從30 min 增至60 min，跑臺坡度為0o。每周一至周五訓練，周六、日休息。T-SE和T-SEG組小鼠則一直處于安靜狀態(tài)。

表1 8周跑臺訓練方案

1.3 給藥方案

在適應性訓練結束以后，T-SEG 和T-EXG 組小鼠給予GNE-317 處理。GNE-317 是一種特異的PI3K∕Akt 信號通路抑制劑，可以穿透血腦屏障，顯著抑制小鼠腦中Akt 的磷酸化，具有高效、長久、低毒的特點[17，18]。將GNE-317按照每只小鼠30 mg∕kg∕天的劑量通過灌胃方式給藥8周[17，18]。

1.4 樣品制備

在最后一次訓練結束后48 h，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，然后斷頭取腦，在冰上迅速分離相同部位大腦皮質(zhì)和兩側海馬組織。每只小鼠一部分大腦皮質(zhì)和同側海馬組織做Western blot實驗，立即放入液氮冷凍，然后轉入－80℃冰箱中保存待測。另一部分大腦皮質(zhì)和另一側海馬組織做TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色，取材清洗后立即放入4%多聚甲醛固定液中進行固定，然后石蠟包埋和切片。

1.5 TUNEL染色

小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織石蠟切片脫蠟水化，每個蠟塊選取5張切片。PBS洗滌后，將切片置于20 μg∕mL 不含DNase 的蛋白酶K 溶液中，室溫孵育30 min。PBS 洗滌5 min×3，然后加入3% H2O2溶液，室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。將切片置于含有0.1% Triton X-100 的PBS 溶液中通透15 min。然后在切片上滴加含有TdT 酶和生物素的TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌后，在切片上滴加終止液，室溫孵育10 min。PBS 洗滌5 min×3，然后在切片上滴加鏈霉親和素-HRP工作液，室溫孵育30 min。PBS 洗滌5 min×3，再在切片上滴加DAB顯色液，室溫孵育10 min。PBS 洗滌5 min×3，用蘇木素染色液進行細胞核染色。PBS洗滌5 min×3，然后封片觀察。每張片子隨機選擇10 個視野計算TUNEL 染色陽性細胞數(shù)量平均值。

1.6 Western blot實驗

將小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織在液氮中研磨后，迅速加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 蛋白裂解液進行細胞組織的充分裂解。4℃，12000 ×g離心15 min，取200 μL 上清液然后加入50 μL 5×蛋白上樣緩沖液，放入100℃水浴鍋中進行蛋白變性，持續(xù)10 min。然后進行SDS-PAGE 電泳，電泳后將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，然后將膜與稀釋好的一抗4 ℃孵育過夜（實驗中用到的一抗PI3K p110、PI3K p85 抗體購自Cell Signaling Technology 公司；Akt、Phospho-Akt Thr308、Phospho-Akt Ser473、Bcl-2、Bad、Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、Cytochrome C 和β-actin 抗體購自Beyotime公司）。次日用TBST洗膜5 min×3，洗去殘留一抗，然后將膜與稀釋好的二抗室溫孵育1 h（實驗中用到的二抗HRP 標記山羊抗兔IgG 和HRP 標記山羊抗小鼠IgG 購自Beyotime 公司），然后用TBST 洗膜5 min×4，以洗去殘留的二抗。最后使用ECL化學發(fā)光試劑和X光片檢測蛋白信號。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Image J軟件進行Western blot條帶的灰度分析，應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。將運動方式和GNE-317給藥作為組間主效應，進行雙因素方差分析，若有交互作用，采用LSD簡單效應檢驗，若無交互作用，則采用獨立樣本t檢驗。文中所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結果的平均值± 標準差，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 有氧運動和GNE-317對PI3K/Akt信號通路的影響

從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，T-EX 組小鼠大腦皮質(zhì)PI3K p110 和p85 亞基的蛋白含量與T-SE 組相比均顯著上升，分別約為T-SE組的1.56倍和1.61倍（P＜0.01）。而在GNE-317 處理8 周后，T-SEG 組和T-EXG 組PI3K p110和p85亞基的蛋白含量分別與T-SE組和T-EX組相比并無顯著差異。

各組小鼠大腦皮質(zhì)中Akt 總蛋白含量并沒有發(fā)生顯著改變。而T-EX 組Thr308 和Ser473 位點的磷酸化水平與T-SE 組相比顯著上升，分別約為T-SE 組水平的1.56 倍和1.76 倍（P＜0.01）。GNE-317 處理8 周后，T-SEG 組和T-EXG 組Thr308 和Ser473 位點的磷酸化水平分別與T-SE 組和T-EX 組相比均顯著下降，其中T-SEG 組Thr308 和Ser473 位點的磷酸化水平分別為T-SE 組水平的61.34%和62.39%（P＜0.05），而T-EXG組Thr308 和Ser473 位點的磷酸化水平分別為T-EX 組水平的61.67%和59.96%（P＜0.01）。

另外，我們在前期的研究中已探究8 周有氧運動和GNE-317對APP∕PS1小鼠海馬組織PI3K∕Akt通路的影響[19]。

圖1 8周有氧運動和GNE-317對APP∕PS1小鼠大腦皮質(zhì)PI3K∕Akt通路蛋白表達的影響（n=10）

2.2 PI3K/Akt通路對有氧運動抑制神經(jīng)細胞凋亡的影響

如圖2所示，在T-SE、T-EX、T-SEG 和T-EXG 組小鼠大腦皮質(zhì)中，TUNEL 染色陽性細胞數(shù)量分別為198 ± 26 個∕mm2、107 ± 24 個∕mm2、294 ± 31 個∕mm2和207 ± 29 個∕mm2（圖2A、B）；海馬組織中TUNEL 染色陽性細胞數(shù)量分別為241 ± 38個∕mm2、125 ± 19個∕mm2、364 ± 35個∕mm2和224 ± 29個∕mm2（圖2C、D）。

2.3 PI3K/Akt通路對有氧運動調(diào)控神經(jīng)細胞凋亡因子的影響

從圖3A 中可以看出，經(jīng)過8 周的有氧運動后，TEX組小鼠大腦皮質(zhì)中抗凋亡因子Bcl-2的水平顯著高于T-SE 組，約為T-SE 組水平的1.56 倍（P＜0.05，圖3B）；促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3的含量顯著下降，分別約為T-SE 組水平的54%（P＜0.05，圖3C）、56%（P＜0.05，圖3D）、42%（P＜0.01，圖3E）、45%（P＜0.01，圖3F）、51%（P＜0.01，圖3G）和61%（P＜0.05，圖3H）。

而GNE-317 處理8 周后，T-SEG 和T-EXG 組抗凋亡因子Bcl-2 的水平分別與T-SE 和T-EX 組相比顯著降低，而促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Caspase-3的水平分別與T-SE和T-EX組相比均顯著上升。其中T-SEG 組Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分別約為T-SE 組水平的52%（P＜0.05，圖3B）、1.62 倍（P＜0.01，圖3C）、1.74 倍（P＜0.01，圖3D）、1.84 倍（P＜0.01，圖3E）、1.62 倍（P＜0.01，圖3F）、1.78 倍（P＜0.01，圖3G）、1.58 倍（P＜0.01，圖3H）。TEXG 組Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分別約為T-EX 組水平的69%（P＜0.05，圖3B）、1.57 倍（P＜0.05，圖3C）、1.41倍（P＜0.05，圖3D）、2.33倍（P＜0.01，圖3E）、1.75倍（P＜0.01，圖3F）、1.80 倍（P＜0.05，圖3G）、1.59 倍（P＜0.01，圖3H）。

圖2 APP∕PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織TUNEL染色（×400，n=10）

圖3 8周有氧運動和GNE-317對APP∕PS1小鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡因子的影響（n=10）

從圖4A 中可以看出，經(jīng)過8 周的有氧運動后，TEX組小鼠海馬組織中抗凋亡因子Bcl-2的水平顯著高于T-SE 組，約為T-SE 組水平的1.89 倍（P＜0.01，圖4B）；促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3的含量顯著下降，分別約為T-SE 組水平的47%（P＜0.01，圖4C）、56%（P＜0.01，圖4D）、51%（P＜0.01，圖4E）、44%（P＜0.01，圖4F）、61%（P＜0.01，圖4G）和57%（P＜0.01，圖4H）。而GNE-317 處理8 周后，T-SEG 和T-EXG 組抗凋亡因子Bcl-2的水平與T-SE和T-EX組相比顯著降低，而促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7和Cleaved Caspase-3 的水平與T-SE 和T-EX 組相比顯著上升。其 中T-SEG 組Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的水平分別約為T-SE 組水平的58%（P＜0.05，圖4B）、1.67倍（P＜0.01，圖4C）、1.54倍（P＜0.01，圖4D）、1.79倍（P＜0.01，圖4E）、1.59 倍（P＜0.01，圖4F）、1.54 倍（P＜0.01，圖4G）、1.67 倍（P＜0.01，圖4H）。T-EXG 組Bcl-2、Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的水平分別約為T-EX 組水平的51%（P＜0.01，圖4B）、1.66 倍（P＜0.05，圖4C）、1.50 倍（P＜0.05，圖4D）、1.84 倍（P＜0.05，圖4E）、1.91 倍（P＜0.05，圖4F）、1.41倍（P＜0.05，5圖4G）、1.42倍（P＜0.05，圖4H）。

圖4 8周有氧運動和GNE-317對APP∕PS1小鼠海馬組織細胞凋亡因子的影響（n=10）

3 討論

神經(jīng)元的大量丟失是AD 病人腦中最為典型的病理特征之一，研究表明主要以神經(jīng)細胞凋亡的形式發(fā)生[20]。細胞凋亡是細胞程序性死亡，受多種基因的共同調(diào)控，如Bcl-2 家族、Caspase 家族、C-myc、p53 等。Bcl-2 家族擁有眾多成員，如Bcl-2、Bax、Bak、Bad、Bim等，其中Bcl-2屬于抗凋亡因子，而Bax、Bak、Bad和Bim屬于促凋亡因子。在DNA 斷裂、氧化損傷以及癌基因活化等因素作用下，Bax、Bak等促凋亡因子改變了線粒體膜的通透性，使線粒體內(nèi)的細胞色素C 得以進入細胞質(zhì)[21]。釋放到細胞質(zhì)中的細胞色素C 在ATP 作用下與銜接蛋白Apaf-1結合形成多聚體，并促使Caspase-9與其結合形成凋亡小體[22]，進一步激活下游Caspase-7、Caspase-6、Caspase-3 等眾多蛋白，最終引起細胞凋亡。而Bcl-2具有抑制Bax和Bak的作用。

越來越多的研究表明，運動能夠延緩神經(jīng)細胞凋亡。Baek等[23]研究發(fā)現(xiàn)4周的跑臺訓練就可以提高AD模型大鼠海馬組織抗凋亡因子Bcl-2含量，降低促凋亡因子Bax 含量，同時減少Caspase-3 陽性細胞數(shù)量。我們在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)12 周的跑臺訓練能夠顯著提高老年大鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中Bcl-2的含量，降低Bax、Cytochrome C 以及Cleaved Caspase-3 的含量，對于抑制神經(jīng)細胞凋亡有積極作用[16]。

而PI3K∕Akt信號通路對于細胞凋亡具有重要調(diào)控作用，活化的Akt 可以磷酸化Bad Ser112∕136 位點[10]、Bax Ser184位點[11]，從而有效阻斷Bad、Bax誘導的細胞凋亡。同時活化的Akt 還可以阻止Caspase-3 和Caspase-9 的活化[12]，促進p53 的失活[13]，阻止線粒體細胞色素C 的釋放[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)有氧運動在抑制神經(jīng)細胞凋亡過程中伴有PI3K∕Akt 信號通路活性的提高[16]。因此，我們推測有氧運動抑制神經(jīng)細胞凋亡很可能是通過激活PI3K∕Akt信號通路發(fā)揮作用的。

為了證明上述推測，我們選擇了APP∕PS1 轉基因小鼠作為模型動物。這是一種廣泛使用的AD 癥模型小鼠，其腦內(nèi)可表達突變的人類早老素和人鼠淀粉樣前蛋白融合體，導致早發(fā)性老年癡呆癥[24]。同時我們利用PI3K∕Akt 信號通路特異性抑制劑GNE-317，通過灌喂的方式處理8 周，抑制小鼠腦中PI3K∕Akt 通路活性。GNE-317 可以穿透血腦屏障，抑制Akt Thr308 位點和Ser473 位點的磷酸化水平[17，18]。經(jīng)過8 周的跑臺訓練后，我們發(fā)現(xiàn)運動組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中PI3K p110 和p85 亞基的蛋白含量顯著提高，并且Akt Thr308和Ser473位點的磷酸化水平也顯著提高；同時，TUNEL 染色陽性細胞數(shù)量顯著減少；進一步發(fā)現(xiàn)抗凋亡因子Bcl-2 含量上升，促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的含量均下降。上述結果說明有氧運動能夠提高APP∕PS1小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織PI3K∕Akt信號通路活性，有效抑制神經(jīng)細胞凋亡。而T-SEG 和T-EXG 兩組在經(jīng)過GNE-317處理8周后，其PI3K p110和p85亞基以及Akt 的總蛋白含量均沒有發(fā)生顯著變化，但是對Akt Thr308和Ser473位點的磷酸化水平有明顯的抑制作用，抑制效率能達到60%，這與文獻中報道的效率相似[17，18]。隨后我們發(fā)現(xiàn)GNE-317處理組TUNEL染色陽性細胞數(shù)量顯著多于未處理組，抗凋亡因子Bcl-2含量顯著下降，促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3 的含量顯著上升。這表明在PI3K∕Akt 信號通路受到抑制的情況下，有氧運動抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用減弱。

4 結論

綜上所述，有氧運動通過增強APP∕PS1 小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中PI3K∕Akt 信號通路活性，提高了抗凋亡因子Bcl-2 的含量，同時降低促凋亡因子Bad、Bax、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-7 和Cleaved Caspase-3的含量，從而有效抑制神經(jīng)細胞凋亡。而抑制PI3K∕Akt 信號通路活性，有氧運動抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用減弱。因此，有氧運動對于預防阿爾茨海默癥具有積極作用。