徐臘紅，陸籽豪，唐歷波，李 櫟

（1.德克薩斯農(nóng)工大學(xué)，德克薩斯 卡城 77843-3741；2.海南醫(yī)學(xué)院高等職業(yè)教育學(xué)院，海南 ?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199）

【研究意義】 DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)短序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)。DNA 條形碼鑒定與其他分子鑒定方法比較具有三大優(yōu)勢(shì)：鑒定結(jié)果具有良好的重復(fù)性；鑒定方法通用性強(qiáng)；并可通過(guò)構(gòu)建數(shù)據(jù)統(tǒng)一的鑒定平臺(tái)，而易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化[1-3]。近年來(lái)，隨著對(duì)DNA 條形碼技術(shù)的深入研究人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在藥用植物鑒定中具有廣泛的應(yīng)用前景，將是中藥鑒定方法的革命性突破。目前，中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則建立了以 ITS2為核心、psbA-trnH為輔的植物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系和以COI為主、ITS2為輔的動(dòng)物類(lèi)藥材DNA條形碼鑒定體系[4]。前者已納入到2010版《中國(guó)藥典》（增補(bǔ)本）。

【前人研究進(jìn)展】 自2003年DNA條形碼被提出以來(lái)，該技術(shù)已成為全球生物分類(lèi)學(xué)的研究熱點(diǎn)和方向。2003年，HEBERT 等對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門(mén)13 320個(gè)物種的CO1（cytochrome c oxidase subunit 1）基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列種間變異能較好地區(qū)分除刺胞動(dòng)物門(mén)以外的物種。隨后的研究中，COI基因被公認(rèn)為動(dòng)物界中標(biāo)準(zhǔn)的DNA 條形碼基因。植物由于在進(jìn)化歷程中容易發(fā)生雜交、網(wǎng)狀進(jìn)化等事件,而且同一基因在不同類(lèi)群的進(jìn)化速率可能不同，導(dǎo)致植物條形碼的研究比動(dòng)物要復(fù)雜得多。近幾年提出了一些植物DNA條形碼候選序列及其組合，但尚未達(dá)成一致意見(jiàn)。2009年，生命條形碼聯(lián)盟植物工作組(the plant working group of the consortium for thebarcode of life,CBOL)分析了550個(gè)物種907個(gè)樣品后，推薦以rbcL+matK組成的復(fù)合序列作為整個(gè)植物界的DNA條形碼序列的通用條形碼序列，但由于擴(kuò)增效率、鑒定成功率等問(wèn)題，其在植物界的通用性仍受到質(zhì)疑。此外，ITS2 片段在物種水平的變異較快，有更多的突變位點(diǎn)以區(qū)分不同的物種，因此在DNA條形碼鑒定物種方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

【本研究切入點(diǎn)】 黎族醫(yī)藥是黎族人民在長(zhǎng)期與疾病斗爭(zhēng)的醫(yī)療實(shí)踐中不斷積累的寶貴經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，是中華民族傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，由于黎族沒(méi)有自己的文字，藥物的名稱和使用方法是靠語(yǔ)言代代相傳，隨著現(xiàn)代醫(yī)藥的普及，這一寶貴的歷史醫(yī)藥文化遺產(chǎn)面臨失傳的危機(jī)，亟待我們進(jìn)行搶救性發(fā)掘和保護(hù)[5]。據(jù)文獻(xiàn)記載和民間調(diào)查，五指山區(qū)黎族使用的藥用植物約有515種，隸屬于125科360屬[6-7]，中大戟科植物多數(shù)種類(lèi)有毒，有毒藥用植物對(duì)治療一些疾病有特殊療效，具有不可替代性，但如果鑒定錯(cuò)誤很容易引起中毒事件，重者甚至?xí)＜盎颊呱?，為確保用藥安全，尋求準(zhǔn)確快速的鑒定大戟科藥用植物的方法是十分必要的。

本課題組之前的研究顯示：候選DNA條形碼ITS2序列對(duì)海南大戟科植物具有較強(qiáng)的鑒定能力[8]，但是，其他熱點(diǎn)DNA條形碼序列對(duì)海南大戟科植物鑒定能力如何還需進(jìn)一步認(rèn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 因此，本研究對(duì)ITS2、ITS、psbA-trnH、rbcL、matKDNA條形碼序列對(duì)海南大戟科植物鑒定能力進(jìn)行比較，以期篩選出用于鑒定海南大戟科植物最優(yōu)的DNA條形碼序列，從而為建立黎族藥用大戟科植快速鑒定方法，確保用藥安全及黎藥的傳承奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大戟科植物材料共29個(gè)種69個(gè)樣本。樣本形態(tài)學(xué)鑒定由海南醫(yī)學(xué)院唐歷波教授完成，憑證標(biāo)本及數(shù)字影像信息保存于海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院。樣本來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物葉片采集 每株采集健康無(wú)病斑葉片，用酒精棉球擦拭去除細(xì)菌等雜物，放入加有變色硅膠（青島海洋化工有限公司）的密封袋中進(jìn)行干燥。

1.2.2 DNA提取 利用MM300 DNA球磨儀（Retsch，德國(guó)）研磨30 s（2 000 r/min）。采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國(guó)）提取總DNA。利用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定樣本DNA的濃度，然后經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步分析DNA提取結(jié)果。

表1 樣本來(lái)源Table 1 Source of samples

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 引物與反應(yīng)條件[9-13]：本研究引物的合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，所使用引物及其相應(yīng)的反應(yīng)條件見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系包括MgCl22 μL（25 mmol/L），dNTP 2 μL（2.5 mmol/L），引物各1.0 μL（2.5 μmol/L），PCR緩沖液2.5 μL，聚合酶1.0 U（博彩生物科技有限公司，中國(guó)），總DNA 1 μL（約30 ng）。PCR儀型號(hào)：promega M7501 PCR Master Mix 10 reactions TAQ。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序工作由深圳華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司完成。

1.2.4 序列分析 采用PCR擴(kuò)增效率、測(cè)序成功率和序列獲得率來(lái)評(píng)價(jià)5對(duì)候選序列的獲得情況。測(cè)序峰圖文件中，ITS2序列依照KELLER等[14]的方法處理，psbA-trnH序列根據(jù)GenBank上的注釋處理，其余序列采用CodonCode Aligner處理，剔除不確定堿基數(shù)目大于10個(gè)和長(zhǎng)度小于100 bp的序列。將拼接后的序列用軟件MEGA6.0進(jìn)行分析比對(duì)[15]，并基于K2P 模型進(jìn)行遺傳距離等分析，使用TAXON DNA軟件分析序列種內(nèi)、種間變異并作barcoding gap圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增率、測(cè)序成功率及序列獲得率分析 本研究通過(guò)比較5條候選序列的PCR擴(kuò)增率(出現(xiàn)明顯PCR條帶即判定為成功)、測(cè)序成功率(測(cè)序后獲得高質(zhì)量的序列即判定為成功)和序列獲得率（序列獲得率=PCR擴(kuò)增效率×測(cè)序成功率）發(fā)現(xiàn)，ITS序列擴(kuò)增效率最高、達(dá)98.4%，psbA-trnH序列居其次、為95.3%，matK序列最低、為62.5%；而測(cè)序成功率以psbA-trnH序列最高、為94.29%，其次是ITS2、為91.34%，ITS序列測(cè)序成功率最低、為78.06%；5條候選序列的序列獲得率分別為86.96%、76.81%、89.86%、79.71%、49.28%（圖1）。

表2 植物DNA條形碼通用引物序列及PCR反應(yīng)條件Table 2 General primer sequence and PCR reaction conditions of plant DNA barcode

圖1 5條序列PCR擴(kuò)增率、測(cè)序成功率及序列獲得率Fig.1 PCR amplification rate,sequencing success rate and sequence acquisition rate of five sequences

2.2 序列長(zhǎng)度和變異系數(shù)分析

用MEGA 6.0軟件對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)分析，比較不同序列比對(duì)長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)數(shù)、信息位點(diǎn)數(shù)等參數(shù)。分析結(jié)果（表3）表明，ITS2序列的變異系數(shù)和信息位點(diǎn)系數(shù)均最大，其次為ITS序列，最小是rbcL序列；psbA-trnH序列的變異系數(shù)大于matK序列，但psbA-trnH序列的信息位點(diǎn)系數(shù)小于matK序列。

2.3 不同序列的Barcoding Gap分析

利用TAXON DNA軟件對(duì)不同DNA條形碼序列對(duì)供試材料種間、種內(nèi)遺傳距離進(jìn)行分析，并作出barcoding gap圖，結(jié)果（圖2）表明，ITS2序列有明顯的barcoding gap，種內(nèi)變異、種間遺傳距離具有明顯差異，形成明顯的種間與種內(nèi)變異間隔區(qū)，該序列種內(nèi)變異幅度較小，種間變異幅度較大，種內(nèi)變異區(qū)間為0.05～0.10，種間變異區(qū)間為0.25～0.30，種間與種內(nèi)變異分布呈兩邊分開(kāi)的趨勢(shì)，有利于物種鑒定；ITS序列存在barcoding gap，但不及ITS2序列顯著，種內(nèi)最大變異距離值1.1716，種間最小變異距離值0.2010，且種內(nèi)變異和種間變異有較多的重疊區(qū)，種內(nèi)和種間變異幅度都較大，不利于物種鑒定；psbA-trnH和matK序列barcoding gap均不明顯，種內(nèi)變異和種間變異有較多的重疊區(qū)，種內(nèi)和種間變異幅度較大，不利于物種鑒定；rbcL序列barcoding gap不明顯，但種內(nèi)變異和種間變異重疊比例較小，該序列種內(nèi)變異幅度較小，種間變異幅度較大，種內(nèi)最大的變異區(qū)間為0.02～0.025。不能作為單獨(dú)的條形碼鑒定物種，但可以作為ITS2的補(bǔ)充條形碼。

表3 5種序列的長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)Table 3 Length,variation sites and information sites of five sequences

圖2 5個(gè)候選序列的barcoding gapFig.2 Barcoding gap of 5 candidate sequences

3 討論

DNA條形碼的核心工作之一是尋找適合的條形碼序列。 與線粒體CO1基因在動(dòng)物條形碼研究中的優(yōu)異表現(xiàn)相比，植物DNA條形碼研究進(jìn)展相對(duì)緩慢[16-19]。由于植物線粒體基因組進(jìn)化速率較慢，因此條形碼序列主要在葉綠體和核基因上進(jìn)行選擇，被提議的候選序列主要有葉綠體編碼區(qū)rbcL、rpoC1、ycf5、matK 和非編碼區(qū)psbA-trnH序列，及核基因ITS、ITS2序列等[20-22]。

本研究通過(guò)對(duì)ITS2、ITS、psbA-trnH、rbcL、matK等熱點(diǎn)條形碼候選序列的分析比較發(fā)現(xiàn)，ITS序列種間變異要小于ITS2序列。其主要原因是ITS序列的變異主要集中在ITS1區(qū)段（平均長(zhǎng)度為250 bp左右）和ITS2區(qū)段（平均長(zhǎng)度250 bp左右），中間有大約160 bp的5.8 S高度保守區(qū)，因而降低了其種間變異[12]，從公布的ITS通用引物來(lái)看，在各個(gè)科屬的通用性較差。本研究中，ITS序列雖然具有較高的序列獲得率，但其物種鑒定效率很低，因其具有較大的種內(nèi)變異不利于分類(lèi)和鑒定。

ITS2在海南大戟科物種鑒定方面具有以下優(yōu)勢(shì)：首先，無(wú)論在新鮮或降解組織中都較容易擴(kuò)增和測(cè)序，具有很高的應(yīng)用價(jià)值；其次，ITS2序列可根據(jù)不同物種類(lèi)型基于隱馬爾可夫模型的HMM 注釋方法[14]去除兩端5.8 S和26 S區(qū)段，獲得標(biāo)準(zhǔn)ITS2間隔區(qū)序列，使后續(xù)數(shù)據(jù)處理更準(zhǔn)確可靠，這也是目前其他候選條形碼序列不具備的優(yōu)勢(shì)。另外，ITS2序列具有進(jìn)化速率快的特點(diǎn)，較高的變異程度使其在區(qū)分物種方面能力較強(qiáng)。psbA-trnH間隔區(qū)在被子植物中具有高度變異性[23]，其兩端具有75 bp的保守區(qū)序列，便于設(shè)計(jì)通用引物[24]，在大戟科中的擴(kuò)增效率達(dá)95.3%，但其序列較長(zhǎng)、存在大量的Poly(A)結(jié)構(gòu)域[25]，降低了測(cè)序的質(zhì)量，同時(shí)在不同物種中普遍存在插入/缺失的情況，從而導(dǎo)致不同物種該片段長(zhǎng)度變異較大，難以進(jìn)行比對(duì)，給數(shù)據(jù)分析帶來(lái)一定的困難。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，psbA-trnH序列雖然具有較高的序列獲得率，但其物種鑒定效率很低，因其具有較大的種內(nèi)變異不利于分類(lèi)和鑒定。

matK序列是植物葉綠體DNA中進(jìn)化較快的一條編碼區(qū)序列，目前對(duì)于matK作為DNA條形碼對(duì)植物的鑒定能力的研究仍存在較大的分歧[13,17,26]。本研究中，matK基因序列獲得率過(guò)低，會(huì)受到擴(kuò)增和測(cè)序的限制，且種內(nèi)與種間變異重疊比例大，物種鑒定效率很低，不適合作為大戟科DNA條形碼鑒定的候選序列。

CBOL在最新的研究中推薦rbcL+matK作為植物條形碼序列[27]。rbcL序列在GenBank中有大量的數(shù)據(jù)，并具有通用、易擴(kuò)增、易比對(duì)的優(yōu)點(diǎn)，盡管rbcL序列種內(nèi)變異和種間變異barcoding gap不明顯，但種內(nèi)和種間遺傳變異重疊較小，序列的種內(nèi)變異幅度和變異樣本數(shù)的比例明顯較小，與其種間變異幅度和變異樣本數(shù)比例較大形成鮮明的對(duì)照，有利于區(qū)分物種。盡管rbcL基因的PCR擴(kuò)增率和序列獲得率都小于ITS2序列，其在種的水平鑒定成功率也不及ITS2序列，但是可將其作為鑒別大戟科植物的DNA條形碼的補(bǔ)充碼，用以證明ITS2序列鑒定物種親緣關(guān)系的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)DNA條形嗎技術(shù)，比較ITS2、ITS、psbA-trnH、rbcL、matK序列對(duì)海南大戟科植物的鑒定能力，結(jié)果表明，在以上候選DNA條形碼中，ITS2條形碼序列對(duì)海南大戟科植物鑒定能力強(qiáng)，可用于海南大戟科植物的快速鑒定。另外，rbcL序列不能作為單獨(dú)的條形碼鑒定物種，但可以作為ITS2的補(bǔ)充條形碼。