孫獻琪 栗玉珍

銀屑病是一種常見的免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，具有冬重夏輕的特點，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。而銀屑病的病因復雜，發(fā)病機制目前仍不清楚，目前認為與遺傳因素、環(huán)境因素及免疫因素等相關[2]。雖然銀屑病發(fā)生發(fā)展的早期階段仍不清楚，但普遍認為MAPK信號通路異常與銀屑病的發(fā)病關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損區(qū) MAPK信號的磷酸化細胞外信號蛋白調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellularsignal-regulated kinace, P-ERK)的活性明顯高于非皮損區(qū)，治療前銀屑病皮損ERK活性明顯高于治療后。而MAPK信號的輸出取決于MAPK磷酸化的程度和持續(xù)時間，這表明信號失活機制與級聯(lián)信號本身的活化一樣重要。雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)是一類廣泛參與機體內(nèi)信號傳導、生長發(fā)育的具有酪氨酸特異性的磷酸酶。它可以介導磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸和磷酸殘留的MAPK的去磷酸化，是一種MAPK的負調(diào)節(jié)劑。目前已知DUSPs在調(diào)節(jié)血管生成因子下游MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用，而MAPK信號通路異常與銀屑病的發(fā)病關系密切，但DUSPs與銀屑病的相關性在國內(nèi)外學者中卻無人探究。

本實驗應用Real-timePCR和Western blot方法檢測尋常型銀屑病和正常對照組的組織中DUSP1和DUSP4的表達情況，從而探討DUSP1和DUSP4與尋常型銀屑病發(fā)病的關系，為闡明銀屑病的發(fā)生發(fā)展機制提供重要的理論支持。

1 材料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫

理委員會的批準，并經(jīng)過患者的知情同意取18例就診于本院皮膚科門診和病房患者的新鮮皮損，取材部位是軀干和四肢。臨床表現(xiàn)均是典型的局限或廣泛分布的鱗屑性的紅斑或者斑塊，通過兩位病理科醫(yī)師進行組織病理學確定診斷，取材前三個月未系統(tǒng)外用治療銀屑病的藥物如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等。15名正常對照組皮膚組織來自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院整形美容科的面部美容手術(shù)患者，均無皮膚疾病。

1.2 試驗儀器及試劑 兔抗人多克隆抗體DUSP1購于美國Abcam公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于美國GIBCO公司，二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。全蛋白抽提試劑盒、Western Blotting和Real-timePCR 檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。DUSP1上游引物5’- GAGCTGTGCAGCAAACAGTC-3’，下游引物5’- GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT -3’，DUSP4上游引物5’- TCACGGCTCTGTTGAATGTC -3’，DUSP4下游引物5’- GATGTCGGCCTTGTGGTTAT -3’，β-actin上游引物5’-CCCTGGCACCCAGCAC-3’，下游引物5’-GCCGATCCACACGGAGTAC-3’引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。

1.3 Real-time PCR檢測尋常型銀屑病DUSP1和DUSP4的表達 從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存管中的試驗組和對照組的皮膚組織，進行新鮮組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄PCR反應體系為總反應物20 μL，包括總RNA 1 μL，引物為 2 μL，dNTPs(10 mM)1 μL，5*TS RT Buffer 5 μL，TransScript RT 1 μL，Rnase-free Water 10 μL見表1。采用PCR儀進行擴增。Real-time PCR反應條件為：94℃變性5 min,94℃ 變性 10 s,57℃ 退火30 s,65℃ 5 s(45個循環(huán)),72℃終延伸5 min。

表1 Real-time PCR 反應體系

1.4 Western blot檢測尋常型銀屑病DUSP1和DUSP4的表達 組織收集后，轉(zhuǎn)至新的預冷的離心管中并加入配制好的冷Lysis Buffer并置于玻璃勻漿器中，手動勻漿，低溫操作；14,000 r/min，4℃離心15 min，分離上清即為全蛋白提取物，蛋白定量；分裝保存于-70℃，避免反復凍融。嚴格按照說明書步驟進行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)模、印記等操作步驟。

1.5 統(tǒng)計學方法 所用的數(shù)據(jù)都是以均數(shù)±標準差的方式表達。兩組之間的均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 尋常型銀屑病患者與對照組中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達水平檢測 為探尋尋常型銀屑病患者皮膚組織中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達情況，我們用Real-time PCR技術(shù)檢測尋常型銀屑病患者皮膚組織和正常對照組組織中DUSP1mRNA和DUSP4mRNA的表達水平。銀屑病組DUSP1 mRNA的相對表達量為0.0939±0.0048, 正常對照組為0.2486±0.0060,P<0.05。銀屑病組DUSP4mRNA的相對表達量為0.3718±0.0370,正常對照組為0.3645±0.0286,P>0.05(圖1)。結(jié)果顯示與正常皮膚組織相比，DUSP1mRNA在尋常型銀屑病中表達水平明顯降低而DUSP4mRNA在銀屑病中表達水平?jīng)]有變化(圖1)。

*P<0.05

2.2 Western blot檢測DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表達 為了檢測在尋常型銀屑病皮膚組織中DUSP1蛋白和DUSP4蛋白的表達量，我們用Western blot提取對照組和實驗組的蛋白進行了檢測。銀屑病組DUSP1蛋白的相對表達量為0.5165±0.0254, 正常對照組為1.2432±0.3260,P<0.05。銀屑病組DUSP4蛋白的相對表達量為0.8018±0.0770,正常對照組為1.3677±0.2287,P>0.05(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比尋常型銀屑病患者皮膚組織中的DUSP1蛋白表達水平下調(diào)而DUSP4組沒有明顯變化(圖2)。

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性免疫介導的炎癥性皮膚病，全世界上約1%～3%的人群飽受其困擾[3,4]。銀屑病不僅是一種皮膚病，而且是一種系統(tǒng)性疾病[5,6]。到目前為止，人類對銀屑病發(fā)病機制的認識都處于初級階段。目前對銀屑病發(fā)病機制的研究普遍認為MAPK信號通路的異常與銀屑病的發(fā)病關系密切。DUSPs可以介導MAPK的去磷酸化，是MAPK的負調(diào)節(jié)劑。而在調(diào)節(jié)血管生成因子下游MAPK信號通路中,DUSPs發(fā)揮著重要作用,并且DUSPs在炎癥性疾病中的作用也被研究證明。但DUSPs在尋常型銀屑病發(fā)病機制中的作用和意義在國內(nèi)外文獻中卻未見報道。

*P<0.05

本實驗研究通過檢測和比較尋常型銀屑病的皮損組織與正常人對照組皮膚組織中DUSP1和DUSP4的表達量，發(fā)現(xiàn)DUSP1在尋常型銀屑病皮損組織中表達水平相對較低，并且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。發(fā)現(xiàn)DUSP4在尋常型銀屑病皮損組織中表達水平和正常人對照組的組織中表達水平不存在明顯差異，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究的結(jié)果提示DUSP1與尋常型銀屑病具有一定的相關性。

DUSP1基因位于人類染色體5q34,定位于細胞核中，它在炎癥反應、血管生成、癌癥、代謝、糖尿病等多種生理過程和疾病中發(fā)揮重要的生理作用[7]。DUSP1的去磷酸化作用主要依賴于MAPK信號通路。近些年來，研究證實DUSP1是炎癥反應重要的負調(diào)控因素之一。DUSP1在炎癥反應中發(fā)揮關鍵性作用，Shen等[8]發(fā)現(xiàn)，當用脂多糖刺激DUSP1基因敲出小鼠的巨噬細胞時，MAPK信號通路激活的強度與激活的時間均大于正常對照組，并同時出現(xiàn)白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎性因子的過度分泌。由此可見，DUSP1是炎癥反應的重要的負調(diào)控因素之一。Czikk和Shen等[9,10]研究證明上調(diào)血管內(nèi)皮細胞中DUSP1的表達，抑制了p38MAPK信號通路的活性從而抑制TNF-α介導了血管內(nèi)皮通透性增加，進而可以抑制粥樣斑塊的形成?？梢姡珼USP1參與調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥的強度，有可能成為治療炎癥相關疾病的新方向。

本實驗有一定局限性和不足之處。實驗選擇的樣本的數(shù)量相對較少且均為中國東北地區(qū)的銀屑病患者。由于本研究的方法的局限性，尚未發(fā)現(xiàn)DUSP1對銀屑病具體的作用機制。在今后的研究中，本課題組還要繼續(xù)上述作用機制的研究，使本課題的理論依據(jù)更加完善。探討DUSPs與尋常型銀屑病發(fā)病機制的關系，為闡明尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展機制提供一定的理論支持。