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        甲狀腺乳頭狀癌組織miR-129 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

        2019-11-19 06:28:26
        浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2019年11期
        關(guān)鍵詞:研究

        李 瀅 劉 芳 馮 利 陳 雙

        甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的頭頸部腫瘤。甲狀腺癌的病理類型包括乳頭狀癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌,其中甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的惡性腫瘤,占甲狀腺癌的70%左右[1]。盡管多數(shù)患者預(yù)后良好,但是仍有一部分PTC 出現(xiàn)高侵襲、早期轉(zhuǎn)移[2]。因此,開展PTC 相關(guān)分子標(biāo)志物的研究,為臨床早期診斷和治療預(yù)后提供新的方法一直是臨床上的研究熱點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為,由正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞,累及周圍組織器官或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個及其復(fù)雜的基因變化[3]。微小RNA-129(miR-129)是一種內(nèi)源性單鏈非編碼的小RNA 分子,有調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增生和凋亡的作用[4]。近年研究發(fā)現(xiàn),miR-129 在結(jié)直腸癌、前列腺癌等中呈低表達(dá)[5-6]。本研究旨在分析miR-129 在PTC 組織表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選取2010 年11 月—2014 年2 月浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))路橋醫(yī)院收治的PTC 患者125 例作為研究對象,其中男32 例、女93例,年齡20~75 歲,平均(40.36±8.42)歲。病理分級和臨床TNM 分期參照國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標(biāo)準(zhǔn)[7]:1 級77 例、2 級48 例;臨床TNM 分期:Ⅰ期24 例、Ⅱ期51 例、Ⅲ期35 例、Ⅳ期15 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過?;颊呔獣员狙芯績?nèi)容并簽署知情同意書。

        1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)(1)均符合國際抗癌聯(lián)盟第6 版甲狀腺癌分期分級標(biāo)準(zhǔn);(2)均進(jìn)行全甲狀腺切除+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃;(3)均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診。

        1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)(1)有嚴(yán)重肝腎功能不全者;(2)合并其他惡性腫瘤者;(3)入院前經(jīng)過放療或化療等治療者;(4)臨床及隨訪資料不完整者。

        1.4 標(biāo)本采集 選取125 例PTC 并行手術(shù)治療患者,收集PTC 癌變組織125 份作為研究組,另在手術(shù)過程中收集125 份距離癌組織邊緣5cm 以上正常甲狀腺組織為對照組,兩組組織標(biāo)本均進(jìn)行miR-129水平的檢測。

        1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組織miR-129mRNA 表達(dá) 采用TRIzol[賽墨飛世爾科技(中國)有限公司,批號ab49534]提取0.3g 甲狀腺癌組織及癌旁組織總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(美國Life Technologies 公司,批號C120835)產(chǎn)生第一鏈互補(bǔ)(c)DNA。使用GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(GAPDH 正向引物5'-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3';反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')。PCR 引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供并合成,序列如下:miR-182 正向引物:5'-CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3',反向引物:5'-CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。具體操作:將2μL RNA 與1μloligo(dT)和10μL 無RNase 的去離子水混合,在PCR 機(jī)中在70℃下孵育5min 并立即在冰上冷卻。通過加入4μL 5X 緩沖液,2μL 10mM 脫氧核糖核苷酸三磷酸,1μL RNA 抑制劑和1μL 逆轉(zhuǎn)錄酶誘導(dǎo)cDNA 合成,然后在PCR 機(jī)中于42℃溫育1h。通過在70℃溫育5min 終止反應(yīng)。使用THUNDERBIRDS YBR qPCR Mix 試劑盒(日本Toyobo Co,Ltd,Tokyo,Japan公司,批號6514)進(jìn)行定量測量。對于PCR,將12.5μL 2XqPCR Mix,2.0μL 每 種 引 物(2.5μM),2.0μL cDNA 和8.5μL 雙蒸水加入0.2mL PCR 管中。擴(kuò)增條件包括40 個循環(huán),95℃,15min,95℃,15s,55℃,30s,72℃,25s。然后將反應(yīng)保持在4℃。使用閾值循環(huán)(Ct)的值確定每個靶基因的mRNA 表達(dá)。在與GAPDH 比較后使用2-ΔΔCT 方法計(jì)算相對表達(dá)。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t 檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,兩組間采用χ2檢驗(yàn),采用Kaplan-Meier 法估計(jì)不同臨床特征PTC 患者的生存情況,通過非條件單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析影響PTC 患者預(yù)后的相關(guān)因素,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組組織標(biāo)本miR-129mRNA 表達(dá)水平比較PTC 患者其PTC 癌變組織miR-129 mRNA 表達(dá)水平低于癌旁正常組織[(0.66±0.21)比(1.89±0.48),P<0.01]。

        2.2 不同臨床特征PTC 患者甲狀腺癌組織miR-129 表達(dá)比較 根據(jù)ROC 曲線取miR-129 mRNA=0.49 時,約登指數(shù)最大為0.38。因此,miR-129 mRNA=0.49 時作為診斷PTC 的截點(diǎn),miR-129 低表達(dá)患者(≤0.49)33 例(26.40%),miR-129 高表達(dá)患者(>0.49)92 例(73.60%)。miR-129 的表達(dá)與PTC 患者其年齡、性別、腫瘤大小情況均無明顯關(guān)系(P>0.05),miR-129 的表達(dá)與PTC 患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級的表達(dá)有顯著關(guān)系(P<0.001、P<0.001、P=0.018),見表1。

        表1 不同臨床特征的PTC 患者其miR-129 表達(dá)情況比較[例(%)]

        2.3 PTC 患者預(yù)后生存情況 本研究125 例PTC患者中,自出院后至隨訪結(jié)束存活4~60 個月,5 年生存率50.40%(63/125)。其中miR-129 高表達(dá)和低表達(dá)患者5 年總生存率分別為72.73%(24/33)和42.39%(39/92),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.4 影響PTC 患者預(yù)后的單因素分析 經(jīng)單因素分析得出:臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達(dá)時患者生存時間均顯著縮短(P<0.05),見表2。

        2.5 影響PTC 患者預(yù)后Cox 多因素分析 經(jīng)多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析得出:臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達(dá)均為影響PTC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.001),見表3。

        3 討論

        機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞因子和基因的表達(dá)與患者治療及預(yù)后情況密切相關(guān)[8],故尋找影響患者病情進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)因素是改善PTC 患者預(yù)后的關(guān)鍵。miRNA是一類長度為20~24nt 的單鏈非編碼微小RNA,廣泛存在于動植物中。腫瘤細(xì)胞組織miRNA 基因的改變存在多樣化,主要以基因缺失、過表達(dá)及基因擴(kuò)增為主[9]。研究表明,miRNA 在細(xì)胞或組織中可充當(dāng)抑癌基因或者促癌基因的角色,直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。相關(guān)研究證實(shí),miR-34、miR-1301、miR-19等在PTC 異常表達(dá),對PTC 患者造成嚴(yán)重影響[11-12]。

        表2 影響PTC 患者預(yù)后的單因素分析

        本組研究中,PTC 癌變組織miR-129 表達(dá)低于癌旁正常組織,患者臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級越高其miR-129 低表達(dá)率明顯升高,這提示miR-129 在機(jī)體中的表達(dá)與PTC 的發(fā)生和疾病進(jìn)展有密切關(guān)系。于浩等[13]研究表明,miR-129 在膀胱癌組織呈低表達(dá)水平,且支持miR-129 可能成為膀胱癌診斷的無創(chuàng)腫瘤標(biāo)記物,可用于早期診斷及預(yù)后判斷和復(fù)發(fā)的預(yù)測。潘印等[14]研究顯示,在前列腺癌患者,miR-129 在腫瘤低分化、病理分期越高中呈低表達(dá)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)miR-129 參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。多因素Cox 回歸分析顯示,臨床分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級2 級及miR-129 低表達(dá)均為PTC 患者預(yù)后獨(dú)立危險因素(P<0.05)。既往研究表明,張力蛋白同源的基因、人類第10 號染色體缺失的磷酸酶及程序性細(xì)胞死亡因子4、肌球蛋白1 等在惡性腫瘤形成過程中起重要作用的抑癌基因,均為miR-129 的下游靶基因,通過調(diào)控這些下游靶基因,進(jìn)而調(diào)控這些因子所在的信號傳導(dǎo)通路,從而在惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起促進(jìn)作用[15]。由此可見,miR-129 在PTC 患者疾病的發(fā)生、進(jìn)展以及預(yù)后中有著重要的影響,因此,miR-129 可作為判斷甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及預(yù)后的生物標(biāo)志物,臨床上檢測miR-129 表達(dá)水平,預(yù)測PTC 患者的預(yù)后情況。

        表3 影響PTC 患者預(yù)后Cox 多因素分析

        綜上所述,在PTC 癌組織miR-129 以較低水平表達(dá),隨患者臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級越高時其表達(dá)率均上升。miR-129 表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展程度和惡性程度呈負(fù)相關(guān),miR-129 低表達(dá)PTC患者預(yù)后相對較差,檢測miR-129 表達(dá)水平有利于PTC 的診斷及預(yù)后評價。但本組研究所選樣本量較少及研究及隨訪時間過短,對于miR-129 的表達(dá)是否受其他因素影響尚未明確,需進(jìn)一步深入研究。

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