王亦如,蔡新華

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科暨區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

心肌梗死是常見的心血管疾病，是臨床主要的致死因素之一[1]。心肌缺血性壞死動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于心血管疾病發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)研究，針對(duì)不同研究目的，適用的動(dòng)物模型也有差異,制備有效的動(dòng)物模型是完成實(shí)驗(yàn)的前提。鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride，ISO)注射是制備心肌缺血性壞死動(dòng)物模型的簡(jiǎn)易方法[2-3]，但目前該方法的藥物使用劑量差別較大[4]。心電圖檢查、心肌標(biāo)志物檢測(cè)與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)是判斷心肌缺血性壞死動(dòng)物模型心肌缺血壞死損傷程度的常用方法[5]。心肌缺血性壞死的特征性心電圖改變是出現(xiàn)ST段抬高、T波異常以及病理性Q波。心肌標(biāo)志物檢測(cè)對(duì)明確心肌缺血性壞死有重要的輔助作用，肌酸激酶(creating kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creating kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)是常用的血清心肌標(biāo)志物，與心肌缺血性壞死進(jìn)展及預(yù)后有明顯關(guān)系[5]。對(duì)心肌缺血性壞死模型的心肌組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察可以直觀觀測(cè)心肌壞死面積[6]。本研究采用不同劑量ISO對(duì)Sprague Dawley(SD)大鼠進(jìn)行腹腔注射，通過觀察各組大鼠心電圖改變、血清心肌標(biāo)志物和心肌缺血性壞死程度的差異，評(píng)估不同劑量ISO制備心肌缺血性壞死動(dòng)物模型的效果，為心肌梗死動(dòng)物模型的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性清潔級(jí)成年SD大鼠42只，體質(zhì)量140～180 g，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔飲用水飼養(yǎng)于濕度恒定、22～26 ℃、安靜、無(wú)強(qiáng)光直射、晝夜交替的室內(nèi)環(huán)境。

1.2 主要試劑與儀器ISO注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字431021344)；心肌酶譜生生物化學(xué)化試劑浙江康特生物有限公司；BH8顯微攝像系統(tǒng)日本Olympus公司，Beckman DXC800數(shù)字成像系統(tǒng)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 動(dòng)物模型制備適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組，每組7只。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠分別按照2、4、6、8、10 mg·kg-1將ISO溶于生理鹽水，配成10 mL工作液進(jìn)行腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d；對(duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。每日注射15 min后及第8天麻醉大病穩(wěn)定后監(jiān)測(cè)大鼠心電圖，觀察大鼠心率、ST段基線偏移高度、T波改變及有無(wú)病理性Q波出現(xiàn)，以判斷大鼠對(duì)ISO的藥物反應(yīng)和心肌缺血性壞死模型的制備情況。

1.4 各組大鼠血清心肌酶檢測(cè)各組大鼠均于連續(xù)7 d腹腔注射結(jié)束后的第2天，給予100 g·L-1的水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔麻醉，待大鼠穩(wěn)定后記錄心電圖，然后胸骨正中位快速開胸，打開心包膜，暴露心臟，用注射器抽取心室血置于 EP管中，室溫靜置2 h，3 000 r·min-1離心20 min,收集血清,用心肌酶譜生物化學(xué)試劑進(jìn)行心肌酶譜學(xué)檢查，檢測(cè)指標(biāo)包括CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-羥丁酸脫氫酶(ɑ-hydroxybutyrate dehydrogenase，ɑ-HBDH)，以輔助判斷大鼠心肌缺血性壞死的程度。

1.5 各組大鼠心肌組織學(xué)觀察各組大鼠采血結(jié)束后取出心臟，取左心室組織，修剪后水平定位、包埋劑包埋，液氮快速冷凍，移入冰凍切片機(jī)內(nèi)，復(fù)溫至與冷凍箱溫度一致后進(jìn)行層厚8 μm切片，組織塊修理到暴露心腔開始收集切片，自然干燥，冷丙酮固定15 min，蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖片，每張切片采集6～10張，利用Photoshop7.0.1軟件進(jìn)行圖片拼接，每例心肌缺血性壞死模型拼接6張完整心室組織橫斷面圖片；利用Image J圖像分析軟件分析心肌缺血壞死區(qū)面積百分比，心肌缺血壞死區(qū)面積百分比=心肌缺血壞死區(qū)面積/心室橫斷面面積×100%。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠心電圖表現(xiàn)結(jié)果見圖1。ISO腹腔注射第7天，對(duì)照組大鼠心電圖表現(xiàn)正常(圖1A)；2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心電圖均可見ST段基線偏移向上抬高、P波與R波間期明顯、T波量小于R波及形成高大的近似“帳篷樣”單波等心肌缺血性改變(圖1B～圖1E)。其中，ISO 4 mg·kg-1組大鼠心率增快，其心電圖ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出現(xiàn)(圖1C)。對(duì)照組及2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率分別為(394.0±7.5)、(403.4±30.2)、(425.6±16.4)、(389.8±13.9)、(390.7±27.5)、(391.5±22.4)次·min-1，2、4 mg·kg-1ISO組大鼠心率高于對(duì)照組，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；6 mg·kg-1ISO組大鼠心率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對(duì)照組；B：2 mg·kg-1ISO組；C：4 mg·kg-1ISO組；D：6 mg·kg-1ISO組；E：8 mg·kg-1ISO組；F：10 mg·kg-1ISO組。

圖1 ISO誘導(dǎo)第7天大鼠心電圖表現(xiàn)

Fig.1 ECG of rats induced by isoproterenol for seven days

2.2 6組大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH水平比較結(jié)果見表1。與對(duì)照組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH顯著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與2 mg·kg-1ISO組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、CK、CK-MB顯著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清LDH顯著升高，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清ɑ-HBDH顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與4 mg·kg-1ISO組比較，6、8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著升高，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與6 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著降低，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與8 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組大鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST和ɑ-HBDH的表達(dá)水平

Tab.1 Comparison of the levels of serum CK,CK-MB,LDH,AST and ɑ-HBDH of rats among the six groups

組別nAST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)CK/(U·L-1) CK-MB/(U·L-1) ɑ-HBDH/(U·L-1)對(duì)照組7766.3±294.5712.5±199.61 133.2±427.4 313.6±110.3 275.9±102.62 mg·kg-1ISO組 7788.5±275.1788.8±275.5 1 485.3±465.1a370.5±98.4a332.6±95.44 mg·kg-1ISO組 71 642.7±522.6ab1 560.3±513.3a4 370.5±731.5ab1 560.3±475.6ab703.2±180.3a6 mg·kg-1ISO 組71 870.9±589.2ab1 769.1±589.4ab5 427.6±1 026.2abc2 228.1±480.0ab 788.3±133.7a8 mg·kg-1ISO組72 117.4±665.3ab 2 123.4±570.2ab5 430.2±997.8abc3 095.4±130.2abcd1 014.7±195.9ab10 mg·kg-1ISO組71 870.1±503.4ab 1 693.5±522.5ab 4 589.4±1 235.3abde1 769.5±408.3abe817.1±199.1ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與2 mg·kg-1ISO組比較bP<0.05；與4 mg·kg-1ISO組比較cP<0.05；；與6 mg·kg-1ISO組比較dP<0.05；與8 mg·kg-1ISO組比較eP<0.05。

2.3 不同劑量ISO組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)結(jié)果見圖2。不同劑量ISO組大鼠均出現(xiàn)心室肌細(xì)胞缺血壞死，壞死區(qū)主要集中在近心內(nèi)膜的心肌層，表現(xiàn)為壞死心肌細(xì)胞溶解消失，大量成纖維細(xì)胞遷移至壞死區(qū)，壞死區(qū)可呈局灶狀或連接成片；非壞死區(qū)肌細(xì)胞間隙增大，肌絲紊亂。2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積百分比分別為(2.54±0.09)%、(11.42±2.15)%、(7.58±1.47)%、(11.43±1.36)%、(9.00±2.24)%。4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積大于 2 mg·kg-1ISO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：對(duì)照組；B：2 mg·kg-1ISO組；C：4 mg·kg-1ISO組；D：6 mg·kg-1ISO組；E：8 mg·kg-1ISO組；F：10 mg·kg-1ISO組?！啊鳌笔救毖獕乃绤^(qū)。

圖2 ISO誘導(dǎo)大鼠心肌缺血性壞死病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×40)

Fig.2 Pathological manifestation of myocardial ischemic necrosis induced by isoproterenol in rats (HE staining，×40)

3 討論

目前，制備心肌缺血性壞死動(dòng)物模型的方法有多種，常用的有結(jié)扎、夾閉冠狀動(dòng)脈使之狹窄或阻塞導(dǎo)致的心肌缺血性壞死，以及注射ISO、垂體后葉素、多柔比星等藥物制備心肌缺血性壞死模型等[3,7]；不同的制備方法均有相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)扎、夾閉冠狀動(dòng)脈等開胸手術(shù)方法制備的模型雖可最大限度模擬臨床上的急性心肌缺血，但受術(shù)中麻醉劑量、創(chuàng)口大小等因素影響，不同模型之間的效果差異很大；藥物干預(yù)法較開胸手術(shù)方法操作更為簡(jiǎn)單、有效，常用于心肌缺血性壞死模型的制備。ISO作用于心臟β1受體，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管，增加心肌收縮力和收縮頻率，增加心肌細(xì)胞耗氧量，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞相對(duì)缺氧，引起心肌細(xì)胞壞死，因此，ISO是常用的制備心肌缺血性壞死動(dòng)物模型的試劑，其具有操作簡(jiǎn)單、動(dòng)物死亡率低的優(yōu)點(diǎn)，但制備模型時(shí)使用劑量存在較大差異[8-11]。以往研究發(fā)現(xiàn)，低劑量ISO可以誘導(dǎo)以心肌纖維化和壞死為特征的動(dòng)物模型[12]。因此，本研究在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，觀察腹腔注射不同劑量ISO對(duì)大鼠心肌缺血性壞死的影響，旨在尋找制備大鼠心肌缺血性壞死模型的最佳劑量。

ISO可以增快心率，增強(qiáng)心肌收縮力，從而使心肌耗氧量增加，進(jìn)而導(dǎo)致心肌供給血氧失衡，最終導(dǎo)致心肌缺血性壞死的發(fā)生[13]。本研究結(jié)果顯示，ISO作用于大鼠后，各給藥組大鼠心率總體隨藥物濃度增大呈先增快后減慢趨勢(shì)，其中2、4 mg·kg-1ISO組大鼠心率高于對(duì)照組，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心率低于對(duì)照組，6 mg·kg-1ISO組大鼠心率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各給藥組大鼠心電圖均可見ST段基線偏移向上抬高、P波與R波間期明顯、T波量小于R波及形成高大的近似“帳篷樣”單波等心肌缺血性改變，提示大鼠心肌缺血性壞死模型構(gòu)建成功；而4 mg·kg-1ISO組大鼠心率增快，且其心電圖ST段呈弓背向上抬高、病理性Q波出現(xiàn)；以上結(jié)果提示，4 mg·kg-1ISO對(duì)大鼠心率、心電圖改變的影響最大。臨床上，檢測(cè)心肌標(biāo)志物對(duì)于明確心肌缺血性壞死有重要的輔助作用，高東雁等[14]研究顯示，ISO誘導(dǎo)后大鼠血清CK和LDH均會(huì)顯著升高。 CK、CK-MB、LDH、AST是常用的血清心肌標(biāo)志物，當(dāng)心肌受損時(shí)，心肌組織中CK、CK-MB、LDH、AST由于心肌細(xì)胞壞死釋放入血，血清心肌酶水平呈現(xiàn)不同程度升高，對(duì)判斷心肌損傷程度有重要輔助價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，在ISO誘導(dǎo)后，與對(duì)照組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、LDH、ɑ-HBDH顯著升高，2、4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著升高；與2 mg·kg-1ISO組比較，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清AST、CK、CK-MB顯著升高，6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清LDH顯著升高，8、10 mg·kg-1ISO組大鼠血清ɑ-HBDH顯著升高；與4 mg·kg-1ISO組比較，6、8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著升高，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高；與6 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK顯著降低，8 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK-MB顯著升高；與8 mg·kg-1ISO組比較，10 mg·kg-1ISO組大鼠血清CK、CK-MB顯著降低。觀察已制備的心肌缺血性壞死模型大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)，可以直觀觀測(cè)心肌組織壞死的面積。本研究結(jié)果顯示，不同劑量ISO組大鼠均出現(xiàn)心室肌細(xì)胞壞死，4、6、8、10 mg·kg-1ISO組大鼠心肌缺血壞死區(qū)面積均大于2 mg·kg-1ISO組，其余組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但4 mg·kg-1ISO組大鼠心電圖呈現(xiàn)典型的缺血性壞死表現(xiàn)，且誘導(dǎo)劑量更低。

綜上所述，不同劑量ISO腹腔注射均可造成大鼠心肌缺血性壞死損傷，但結(jié)合對(duì)心電圖、血清心肌酶譜變化及心肌缺血壞死面積的影響，4 mg·kg-1ISO腹腔連續(xù)注射制備大鼠心肌缺血性壞死大鼠模型的效果最佳。