曹軍濤，王秀巖，郭宜姣，劉 超

(1.洛陽(yáng)東方醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽(yáng) 471003；2.天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所，天津 300222)

糖尿病是導(dǎo)致心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，2型糖尿病患者發(fā)生缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病人群的2～4倍，且糖尿病患者心肌梗死后的病死率更高[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，在Zucker肥胖大鼠中，缺血/再灌注(ischemia reperfusion，IR)組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明糖尿病會(huì)提高缺血心肌的易損性[3-5]。如何在高血糖的情況下進(jìn)行缺血預(yù)處理及后處理來(lái)保護(hù)心肌一直是學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。異丙酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解糖尿病大鼠心肌IR損傷[6]，但其作用機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)緩解非糖尿病大鼠心肌IR損傷[7-8]。本研究旨在探討異丙酚對(duì)2型糖尿病大鼠IR損傷心肌的保護(hù)作用及作用機(jī)制，以期為臨床診治提供治療靶點(diǎn)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器鏈脲佐菌素購(gòu)天津亞寶藥業(yè)科技有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)定H12020212)公司，100 g·L-1水合氯醛購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，異丙酚購(gòu)自意大利Astra Zeneca公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20030199)；肌酸激酶(creatine kinase，CK)檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、電化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，人Bcl-2、Caspase-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗鼠Bax多克隆抗體購(gòu)自德國(guó)默克公司；683小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自北京友誠(chéng)嘉業(yè)生物科技有限公司，AS/3麻醉監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自廣州美倫安迪電子科技有限公司，WZS-50F6微量輸液泵購(gòu)自上海致衡醫(yī)療器械有限公司，SC-T10數(shù)碼相機(jī)購(gòu)自日本Sony公司，Image J軟件購(gòu)自美國(guó)Wayne Rasband National Institutes of Health公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立、實(shí)驗(yàn)分組及各組干預(yù)措施參照文獻(xiàn)[9]的方法制備大鼠2型糖尿病模型。大鼠給予高脂高糖喂養(yǎng)5周后，經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥2 d，3 d后經(jīng)尾靜脈采血測(cè)大鼠空腹血糖，2型糖尿病模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠出現(xiàn)多尿、多飲，且血糖值≥16.7 mmol·L-1。

選取2型糖尿病模型制備成功的大鼠54只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、IR組和異丙酚組，每組18只。IR組和異丙酚組大鼠采用Koizumi線栓法制備缺血再灌注模型，2組大鼠采用100 g·L-1水合氯醛麻醉后給予氣管插管，連接683小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。采取股動(dòng)脈及靜脈穿刺置管，將穿刺置管連接到麻醉監(jiān)測(cè)儀和輸液泵，監(jiān)測(cè)大鼠的血壓和給藥情況。待大鼠血壓和心率穩(wěn)定后，取右側(cè)臥位，在第3～5肋間進(jìn)行開(kāi)胸，剪開(kāi)大鼠心包，在冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿5-0絲線，在大鼠心肌和結(jié)扎線間墊聚乙烯硬管，收緊結(jié)扎線后能夠看見(jiàn)結(jié)扎部位以下心肌顏色顯著變暗，心電圖主要表現(xiàn)為ST段抬高，即為缺血成功。大鼠缺血 30 min后剪開(kāi)結(jié)扎線恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注2 h，心臟表面顏色變?yōu)榧t色、抬高的ST段下降在1/2以上即判定為再灌注成功。異丙酚組大鼠缺血前10 min靜脈泵注異丙酚6 mg·kg-1至術(shù)后2 h，假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。

1.3.2 各組大鼠血清CK、LDH活性及SOD、MDA水平測(cè)定IR損傷模型建立前1 h和IR損傷模型建立1 h后通過(guò)股動(dòng)脈采集大鼠外周血。采用速率法檢測(cè)大鼠血清CK、LDH活性，采用比色法檢測(cè)血清中SOD、MDA含量；嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化及心肌梗死范圍IR損傷模型建立后斷頭處死大鼠，取心肌組織，一半置于液氮凍存心肌組織，另一半置光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的病理學(xué)變化，然后將大鼠心臟橫斷面切成2 mm切片，分別稱(chēng)切片質(zhì)量，然后置于10 g·L-1伊文藍(lán)染液中染色20 min(37 ℃)，用數(shù)碼相機(jī)拍照，以Image J (1.31v)軟件計(jì)算心肌梗死范圍大小。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)取液氮凍存的大鼠心肌組織，研磨成粉末，充分裂解30 min后，在4 ℃下12 000×g離心30 min，取上清液，采用蛋白活性測(cè)定試劑盒對(duì) Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白進(jìn)行定量分析。取30 μg Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下在體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶中反應(yīng)1 h，充分洗滌后分別加入一抗小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(11 000)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(11 000 )及兔抗人Caspase-3 單克隆抗體( 11 000 )，4 ℃下反應(yīng)過(guò)夜，充分洗滌后加入二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(11 000)或者辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(110 000)，室溫條件下反應(yīng)30 min，充分洗滌后，電化學(xué)發(fā)光(electrochemi-luminescence，ECL)反應(yīng)1 min，采用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照觀察和定量分析，結(jié)果用光密度值來(lái)代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠心肌組織病理學(xué)變化結(jié)果見(jiàn)圖1。假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯壞死和出血，無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；IR組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)灶狀壞死及出血，有明顯的收縮帶，并存在大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；異丙酚組大鼠心肌組織病理學(xué)改變較IR組明顯減輕，可見(jiàn)少量出血及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，有少量固縮細(xì)胞。

A：假手術(shù)組；B：IR組；C：異丙酚組。

圖1 3組大鼠心肌組織病理學(xué)變化(伊文藍(lán)染色，×100)

Fig.1 Histopathological changes of myocardium tissue of rats in the three groups(Ewen blue staining，×100)

2.2 3組大鼠心肌梗死范圍比較假手術(shù)組、IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍分別為(0.05±0.01)、(56.39±3.08)、(45.81±3.41) mm3; IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍大于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠心肌梗死范圍小于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較結(jié)果見(jiàn)表1。IR前3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IR后，IR組、異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平高于IR前，SOD水平低于IR前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；假手術(shù)組大鼠IR前后血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IR后，IR組和異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平高于假手術(shù)組，SOD水平低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠血清LDH、CK及MDA水平低于IR組，SOD水平高于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠血清LDH、CK、MDA及SOD水平比較

組別nLDH/ (mg·L-1)CK/ (mg·L-1)MDA/ (mg·L-1)SOD/ (mg·L-1)假手術(shù)組18 IR前682.13±61.14699.93±62.277.46±0.67235.49±9.31 IR后789.31±175.37771.25±182.418.15±0.56 229.65±7.25IR組18 IR前715.41±65.27785.62±69.899.08±0.75 217.21±4.16 IR后3 548.62±193.25ab4 125.31±201.50ab25.38±0.78ab 70.27±6.58ab異丙酚組18 IR前694.23±60.31721.45±66.428.56±0.56 225.55±3.51 IR后2 946.37±184.42abc3 431.52±199.35abc19.55±0.84abc88.57±7.41abc

注：與IR前比較aP<0.05 ;與假手術(shù)組比較bP<0.05 ；與IR組比較cP<0.05。

2.4 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。IR組和異丙酚組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；異丙酚組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于IR組，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)(Western blot)

Fig.2 Expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein in myocardium tissue of rats in the three groups(Western blot)

表2 3組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

組別nBcl-2BaxCaspase-3假手術(shù)組 18698.36±30.981 263.58±22.991 509.02±46.26IR組181 260.95±32.25a2 250.15±36.59a1 921.35±36.80a異丙酚組 181 675.12±45.26ab1 822.49±30.55ab1 760.52±40.99abF4.3605.96825.269P0.1250.0830.001

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05；與IR組比較bP<0.05。

3 討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道的糖尿病大鼠心肌IR損傷模型多數(shù)為1型糖尿病[10-11]，而臨床上2型糖尿病的發(fā)病率顯著高于1型糖尿病，因此，本研究在2型糖尿病模型的基礎(chǔ)上制備大鼠心肌IR損傷模型，并探討異丙酚對(duì)其的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可抑制大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化，改善線粒體功能，保護(hù)心肌，降低心肌IR損傷[12]，即異丙酚對(duì)大鼠離體心臟 IR損傷有一定的保護(hù)作用，其可能作用機(jī)制為減少I(mǎi)R所致的氧化應(yīng)激，抑制線粒體途徑的凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解糖尿病大鼠心肌IR誘導(dǎo)的心肌損傷并促進(jìn)大鼠心功能的恢復(fù)[14-15]。心肌缺血可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而再灌注可使細(xì)胞凋亡大幅增加[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠緩解2型糖尿病大鼠IR誘導(dǎo)的心肌損傷。

心肌IR損傷是由多種因素導(dǎo)致的，其中氧化應(yīng)激是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MDA是不飽和脂肪酸在自由基作用下產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，SOD則能夠清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，IR后IR組、異丙酚組大鼠心肌梗死范圍變大，血清LDH、CK、MDA水平升高，SOD水平降低；異丙酚組大鼠心肌梗死范圍小于IR組，血清LDH、CK、MDA水平低于IR組，SOD水平高于IR組；提示通過(guò)阻斷糖尿病過(guò)程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能對(duì)心肌IR損傷有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌IR中起關(guān)鍵作用。在糖尿病心肌IR動(dòng)物模型的心臟中，Bcl-2和Bax 2種調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變。Bcl-2屬于抑凋亡基因，Bax屬于促凋亡基因，二者能夠形成Bcl-2/Bax同源二聚體[21]。Caspase-3是一種參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行凋亡的蛋白酶。Bcl-2表達(dá)下調(diào)和Bax表達(dá)上調(diào)能夠激活Caspase-3，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，IR組和異丙酚組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)上調(diào)；與IR組比較，異丙酚組大鼠心肌組織中Bax和Caspase-3的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)。提示異丙酚減輕2型糖尿病大鼠心肌IR損傷的機(jī)制與上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，異丙酚能夠有效緩解2型糖尿病大鼠心肌IR損傷，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。